劉歡歡，陳 曦，余樹(shù)民，宋 品，沈留紅，曹隨忠，左之才，馬曉平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014)

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是位于睪丸曲細(xì)精管基膜的一類(lèi)成體干細(xì)胞，既可自我更新維持?jǐn)?shù)量穩(wěn)定，也能在體內(nèi)定向分化產(chǎn)生精子，調(diào)節(jié)SSCs 在自我更新和分化之間的平衡是維持動(dòng)物終身正常精子發(fā)生的關(guān)鍵［1］。SSCs 自我更新與分化之間的平衡的維持依賴(lài)于精原干細(xì)胞微環(huán)境，微環(huán)境中的膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell line－derived neurotrophic factor，GDNF)是調(diào)控SSCs自我更新和分化的關(guān)鍵因子。

GDNF 屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF－β)超家族，是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞發(fā)育和分化的信號(hào)分子，在神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的發(fā)育中有重要作用［2］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，GDNF 也在雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育和睪丸發(fā)育早期中發(fā)揮作用［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，GDNF 基因功能缺失(GDNF+/－)小鼠能精子發(fā)生紊亂，出現(xiàn)唯支持細(xì)胞表型;而GDNF 超表達(dá)，SSCs 則不能分化形成精子，表明GDNF 在SSCs 自我更新和分化的調(diào)節(jié)中有重要作用［5］。體外SSCs 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，GDNF在多種哺乳動(dòng)物的SSCs 增殖、未分化狀態(tài)的維持、凋亡的抑制方面有重要作用［6－7］。

1 GDNF 的合成調(diào)控

睪丸中的GDNF 由支持細(xì)胞［5］、管周肌肉樣細(xì)胞［8］、精母細(xì)胞和球形精子［9］分泌，其中支持細(xì)胞分泌的GDNF 是睪丸中的GDNF 的最主要來(lái)源。支持細(xì)胞中GDNF 的呈現(xiàn)曲細(xì)精管上皮周期依賴(lài)性表達(dá)，在小鼠中，GDNF 在Ⅻ－Ⅱ期表達(dá)量高，此時(shí)期為SSCs 的增殖時(shí)期，而在Ⅶ－Ⅷ期，SSCs 分化階段，GDNF的表達(dá)量低［10］。GDNF 的表達(dá)受到FGF2、FSH、睪酮、TNF－α 和IL－1β 等［11－12］的調(diào)控，其中FSH 是睪丸中GDNF 濃度的最主要調(diào)節(jié)因子。

2 GDNF 介導(dǎo)的信號(hào)通路

GDNF 通過(guò)由GDNF 結(jié)合受體(GDNF family receptor α1，GFRα1)和跨膜酪氨酸激酶RET(RET proto－oncogen)組成的雙受體系統(tǒng)發(fā)揮作用，GFRα1和RET 僅在SSCs 中共表達(dá)，GFRα1 和Ret 基因敲除動(dòng)物與GDNF 敲除動(dòng)物相同的表現(xiàn)型［13］。GDNF與SSCs 膜上的GFRα1 結(jié)合形成GDNF－GFRα1 復(fù)合物，結(jié)合并活化RET，并進(jìn)一步激活MAPK、SFK和PI3K－AKT 信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)SSCs 的自我更新和分化［14］。

2.1 MAPK 信號(hào)通路

MAPKs 包括ERK 和P38 MAPK，其中ERK 信號(hào)主要通過(guò)調(diào)節(jié)SSCs 細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，而P38MAPK 則主要調(diào)節(jié)SSCs 自我更新。如圖1 藍(lán)色線部分所示，GDNF－GFRα1 復(fù)合體誘導(dǎo)RET 磷酸化，活化的RET 與含SHC 結(jié)構(gòu)的蛋白結(jié)合(如SRC)，促使SHC 活化并與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白(growth factor receptor－bound protein 2，GRB2)的結(jié)合。GRB2 與質(zhì)膜上的RAS 蛋白結(jié)合，激活RAS－ERK1/2 信號(hào)通路，誘導(dǎo)cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB－1)、激活轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor－1，ATF－1)和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)與案件調(diào)節(jié)蛋白(cyclic AMP element modulator 1，CREM－1)等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和活化，上調(diào)c－FOS、Cyclin A 和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)的表達(dá)。Cyclin A 和CDK2 協(xié)同控制細(xì)胞進(jìn)入S 期，CREB－1 和c－FOS 可以增強(qiáng)Cyclin A 的表達(dá)和調(diào)節(jié)有絲分裂G1/S 期的轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞進(jìn)入S期，調(diào)節(jié)DNA 合成和細(xì)胞增殖［15－16］。

此外，GDNF 也能活化P38MAPK 信號(hào)通路(圖1 綠線部分)，上調(diào)BCL6b、ETV5 和LHX1 表達(dá)，調(diào)節(jié)SSCs 的自我更新，但不同遺傳背景的SSCs 對(duì)該信號(hào)通路的反應(yīng)性有所差異［17］。

GDNF 與GFRα1 結(jié)合，活化RET，進(jìn)而激活RAS－ERK1/2 信號(hào)通路［18］(藍(lán)線)、SFK 信號(hào)通路［19］(紫線)、PI3K－ATK 信號(hào)通路［19］(黃線)和P38 MAPK 信號(hào)通路［17］(綠線)。

圖1 GDNF 介導(dǎo)的信號(hào)通路Fig 1 The GDNF mediated signaling pathways

2.2 SFK 信號(hào)通路

SRC 家族激酶(src family kinase，SFK)主要有SRC、YES、LYN 和FYN，其中SRC 和YES 在SSCs對(duì)GDNF 的應(yīng)答中占主要作用［18］。SFK 信號(hào)是調(diào)節(jié)SSCs 自我更新的主要信號(hào)，如圖1 紫線部分所示，Src 家族激酶活化后，特異性地上調(diào)BCL6b、ETV5 和LHX1 的表達(dá)，促進(jìn)SSCs 增殖［19］。

2.3 PI3K-AKT 信號(hào)通路

AKT 信號(hào)可由SFK 和PI3K 激活，在SSCs 中主要由PI3K 激活，AKT 信號(hào)活化后，上調(diào)BCL6b、ETV5 和LHX1 的表達(dá)，調(diào)控SSCs 的自我更新，但AKT 信號(hào)并非主要作用于調(diào)節(jié)SSCs 自我更新而是主要作用于維持SSCs 存活，AKT 除調(diào)節(jié)BCL6b、ETV5 和LHX1 表達(dá)，也調(diào)節(jié)與SSCs 存活有密切關(guān)系的PLZF 和POU5f1 表達(dá)(圖1 黃線部分)，使用LY294002 阻斷AKT 信號(hào)后，SSCs 出現(xiàn)顯著地凋亡［20］。

3 SSCs 內(nèi)受GDNF 調(diào)控的自我更新相關(guān)基因

GDNF 對(duì)SSCs 自我更新調(diào)控通過(guò)調(diào)節(jié)SSCs 內(nèi)自我更新相關(guān)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，這些因子包括ETS轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(ETS variant gene 5，ETV5)、原癌基因BCL6 表達(dá)蛋白(B－cell CLL/lymphoma 6－member B，BCL6b)和LIM 同源框1 (LIM homeobox 1，LHX1)。

ETV5 又叫ERM(ETS related molecule)，屬于ETS 轉(zhuǎn)錄因子家族，具有保守的DNA 結(jié)合ETS 結(jié)構(gòu)域，在多種器官中表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面有重要作用［18］。在睪丸中ETV5 在SSCs 和支持細(xì)胞中均有表達(dá)，在動(dòng)物出生后睪丸發(fā)育中有重要作用，是調(diào)節(jié)SSCs 自我更新的關(guān)鍵因子［21－23］。ETV5－/－小鼠與能生長(zhǎng)至成年且可育，但隨后出現(xiàn)SSCs 自我更新障礙，最終曲細(xì)精管中SSCs 耗竭，形成唯支持細(xì)胞表型，而ETV5－/－SSCs 體外增殖能力顯著下降［17］。

BCL6b 屬于POZ (poxvirus and zinc finger)家族，僅在未分化精原細(xì)胞中表達(dá)，是SSCs 自我更新又一關(guān)鍵因子［18］。siRNA 體外干擾實(shí)驗(yàn)顯示抑制BCL6b 表達(dá)引起SSCs 集落數(shù)量顯著降低但并不出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡［22］;而B(niǎo)CL6b 基因敲除小鼠呈現(xiàn)精子發(fā)生紊亂，睪丸曲細(xì)精管表現(xiàn)唯支持細(xì)胞表型［24］。

LHX1 屬于同源盒基因LIM 家族，在動(dòng)物器官發(fā)生和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用［18］。LHX1 也在未分化精原細(xì)胞中表達(dá)，主要作用在于維持SSCs 數(shù)量穩(wěn)定［21］。LHX1 基因敲除小鼠在出生前后即發(fā)生死亡，siRNA 干擾降低LHX1 表達(dá)水平，SSCs 增殖明顯受到抑制［20］。但LHX1 超表達(dá)SSCs 并不能維持長(zhǎng)期增殖，表明LHX1 不能單獨(dú)維持SSCs 自我更新，需要其他因子的協(xié)同作用［17］。

4 小結(jié)

綜上所述GDNF 與SSCs 膜上的GFRα1 結(jié)合形成GDNF－GFRα1 復(fù)合物，結(jié)合并活化RET，并進(jìn)一步激活MAPK、SFK 和PI3K－AKT 信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)SSCs 的自我更新和分化。GDNF 調(diào)節(jié)SSCs 的自我更新和分化是通過(guò)改變濃度實(shí)現(xiàn)的，高濃度的GDNF 可以顯著促進(jìn)SSCs 增殖，低濃度的GDNF 對(duì)SSCs 的數(shù)目沒(méi)有顯著的影響，但比較GDNF 和不添加GDNF 培養(yǎng)后的細(xì)胞成分發(fā)現(xiàn)，添加GDNF 時(shí)SSCs 基本維持未分化狀態(tài)，而不添加GDNF 時(shí)SSCs出現(xiàn)不同程度的分化［25］。但具體GDNF 濃度為多少時(shí)為高濃度和低濃度仍不明確，以及這一高低濃度是否存在物種的差異性仍有待進(jìn)一步研究。

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