王海潔，范 微，劉朋朋，王忠東，王亞平，格日力*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)中心，青海西寧810001;2.青海省地方病預(yù)防控制所，青海西寧810000)

研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors)HIF-1α和HIF-2α 在高原土著動(dòng)物藏羚羊、高原鼠兔的多種組織中均表達(dá)增高，表現(xiàn)出一定的組織差異性［1］。高原根田鼠(plateau microtus oeconomus)也是一種棲居于青藏高原的土著小型哺乳動(dòng)物，其不同組織HIF-lα 及HIF-2α 的表達(dá)情況如何，目前尚無研究。本研究通過檢測(cè)高原根田鼠HIF-lα及HIF-2α mRNA 的組織表達(dá)情況，揭示高原根田鼠在低氧環(huán)境下HIF-lα 及HIF-2α 基因的表達(dá)特征及其對(duì)該物種生存適應(yīng)的生理意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理:高原根田鼠20 只，體質(zhì)量20～25 g，捕獲于青海省海北地區(qū)，平均海拔4 000 m。雄性KM 小鼠40 只，體質(zhì)量20～25 g［中國藥科大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào):scxk(蘇)2009-009］，其中20 只由南京運(yùn)至西寧后，置海拔4 000 m 低壓氧艙30 d，作為高海拔小鼠組。另外20只(南京，海拔10 m)作為對(duì)照組，各組動(dòng)物處死前取血，取心、肝、肺和腎組織液氮凍存待測(cè)。

1.1.2 試劑:Trizol RNA 提取試劑(Invitrogen 公司)，Script RT Kit(TaKaRa 公司)，2 ×SYBR Premix Ex Taq(ABI 公司)，目的基因HIF-1α、HIF-2α 及內(nèi)參基因18S rRNA 上、下游引物(Invitrogen 公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)及紅細(xì)胞壓積(HCT)水平的測(cè)定:全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行靜脈全血HGB、RBC 及HCT 測(cè)定，嚴(yán)格按照儀器使用說明進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定組織HIF-1α 及HIF-2α mRNA 表達(dá)水平:提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)不同組織HIF-1α 及HIF-2α mRNA 表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)體系為20 μL 體系，反應(yīng)條件為:50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 3 組動(dòng)物HGB、RBC 和HCT 水平比較:高海拔小鼠的HGB、RBC 和HCT 水平均明顯高于對(duì)照組，而高原根田鼠以上指標(biāo)水平無明顯變化(表1)。

表1 3 組動(dòng)物HGB，RBC 和HCT 水平Table 1 The levels of HGB，RBC and HCT in three groups(±s，n=20)

表1 3 組動(dòng)物HGB，RBC 和HCT 水平Table 1 The levels of HGB，RBC and HCT in three groups(±s，n=20)

*P＜0.05 compared with control group.

groupHGB(g/L)RBC(×1012/L)HCT(%)control115 ±295.96 ±1.4332.32 ±7.12 high altitude mice186 ±42*9.24 ±2.14*50.53 ±10.98*plateau microtus oeconomus 119 ±326.11 ±1.7531.80 ±6.86

2.2 3 組動(dòng)物4 種組織HIF-1α 及HIF-2α mRNA 表達(dá)水平比較:結(jié)果采用2－ΔΔCt法計(jì)算，高原根田鼠4 種組織中HIF-1α及HIF-2α mRNA 的表達(dá)量均高于高海拔小鼠和對(duì)照組;高海拔小鼠4 種組織中HIF-1α 及HIF-2α mRNA 的表達(dá)量高于對(duì)照組(表2)。

3 討論

本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)了3 組動(dòng)物不同組織中HIF-1α 及HIF-2α mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HIF-1α 及HIF-2α mRNA 在高原根田鼠4 種組織中表達(dá)均明顯高于其他兩組，其中在心肺組織中的表達(dá)更高。已知高原低氧環(huán)境下，HIF-1α 和HIF-2α 是以協(xié)同作用方式維持機(jī)體氧及能量平衡狀態(tài)，有效促進(jìn)機(jī)體對(duì)低氧的適應(yīng)［2］。低氧誘導(dǎo)HIF-1α 及HIF-2α 的表達(dá)增高可以有效調(diào)節(jié)糖酵解相關(guān)酶、肌紅蛋白、肺表面活性物質(zhì)［3］等諸多參與氧代謝的下游靶基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯增高，可保持血流通暢，從而確保根田鼠最大限度地?cái)z取及利用氧，增強(qiáng)其心肺功能，提高其運(yùn)動(dòng)和避險(xiǎn)能力，保持機(jī)體氧平衡，從而使其能夠在高原低氧環(huán)境中生存和繁衍。因此，HIF-1α、HIF-2α 的組織特異性表達(dá)及表達(dá)增高可能是高原土著動(dòng)物所具有的共性，也是維持低氧環(huán)境下生物體功能活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的分子基礎(chǔ)。同時(shí)，高海拔小鼠組織中HIF-1α、HIF-2α mRNA 的表達(dá)高于低海拔小鼠，認(rèn)為暴露于低氧環(huán)境一段時(shí)間后，小鼠對(duì)低氧環(huán)境也表現(xiàn)出一定的適應(yīng)能力，但其低氧適應(yīng)能力低于高原根田鼠，且其外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高，使血流緩慢，不利于氧的運(yùn)輸及利用。

表2 3 組動(dòng)物不同組織HIF-1α 及HIF-2α mRNA 表達(dá)水平Table 2 The expressions of HIF-1α and HIF-2α mRNA in three groups(±s，n=20)

表2 3 組動(dòng)物不同組織HIF-1α 及HIF-2α mRNA 表達(dá)水平Table 2 The expressions of HIF-1α and HIF-2α mRNA in three groups(±s，n=20)

*P＜0.05 compared with control group，#P＜0.05 compared with high altitude mice.

group HIF-1α HIF-2 α heartliverlungkidneyheartliverlungkidney control0.43 ±0.080.39 ±0.030.45 ±0.090.42 ±0.040.67 ±0.080.64 ±0.030.65 ±0.090.69 ±0.04 high altitude mice 1.79 ±0.46* 0.99 ±0.11* 5.38 ±1.85* 1.03 ±0.22* 2.02 ±0.75*1.03 ±0.34* 2.96 ±0.86* 1.15 ±0.07*plateau microtus oeconomus 3.26 ±1.21# 2.04 ±0.98# 11.07 ±3.01# 1.87 ±0.57# 4.19 ±1.23#1.88 ±0.41# 7.18 ±2.33# 1.96 ±0.21#

綜上所述，高原根田鼠HIF-1α、HIF-2α mRNA 存在組織特異性的高表達(dá)，其能在青藏高原這一嚴(yán)重低氧環(huán)境下繁衍生存與其內(nèi)在的HIF-1α 及HIF-2α 的基因表達(dá)有著內(nèi)在的聯(lián)系。

［1］劉芳.藏羚羊STAT3、HIF-1α 和HIF-2α 基因表達(dá)的生物學(xué)意義［D］.青海:青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2012，62-68.

［2］Bougatef F，Menashi S，Khayati F，et al.EMMPRIN promotes melanoma cells malignant properties through a HIF-2 alpha mediated up regulation of VEGF receptor-2［J］.PLoS One，2010，5:12265-12275.

［3］Saini Y，Harkema JR，LaPres JJ.HIF1alpha is essential for mnormal intrauterine differentiation of alveolar epithelium and surfactant production in the newborn lung of mice［J］.J Biol Chem，2008，283:33650-33657.