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泛素蛋白酶體系統(tǒng)在Wnt通路中的研究進展

朱劍軍，朱曉華，黃平，蔣輝，鄧世山

(川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，四川南充637000)

【摘要】Wnt信號傳導通路是一個由多種分子參與、相互影響、相互制約和協同作用的復雜體系，與細胞信號轉導、細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡、細胞黏附和遷移以及干細胞的分化潛能等有關。泛素蛋白酶體系統(tǒng)通過調控蛋白活性、亞細胞定位以及蛋白間相互作用等方式在細胞活動中發(fā)揮重要的作用。Wnt信號傳導通路中β-catenin等關鍵分子受泛素蛋白酶體途徑精密調控。本文就泛素蛋白酶體系統(tǒng)和Wnt通路信號傳導相互之間的關系作一綜述。

【關鍵詞】泛素蛋白酶; Wnt; E3連接酶;β-catenin

泛素蛋白酶體途徑由泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、26S蛋白酶體和去泛素化酶組成。泛素蛋白酶體途徑在各種細胞活動中均發(fā)揮著重要的調控功能，如胞膜蛋白運輸、細胞周期調控、病毒感染、DNA修復和基因轉錄等。Wnt信號通路也稱為Wnt/β-catenin信號通路。Wnt信號通路未激活時，胞漿內的β-catenin一部分與細胞膜上的鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)結合，一部分與軸蛋白(Axin)、腺瘤性結腸息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、酪蛋白激酶1(casein kinase，CK1)、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK3β)形成復合物，繼而被磷酸化，磷酸化的β-catenin被泛素連接酶E3識別并泛素化，最終導致β-catenin通過蛋白酶體途徑被降解。當Wnt蛋白與其受體蛋白結合后，受體蛋白通過與Dsh的相互作用及一系列胞質蛋白的相互作用使β-catenin在細胞漿內積累繼而轉位入核，與核內轉錄因子TCF/LEF1共同作用，激活下游靶基因，最終導致Wnt信號通路激活。

1　經典的Wnt信號通路與惡性腫瘤

1.1腺瘤性結腸息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)

APC基因的突變可以導致家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)［1］。資料證明，約有85％的散發(fā)性結腸腺癌患者的發(fā)病與APC基因的突變有關［2］。突變的APC基因缺失了與Axin的結合序列，因而不能與Axin、CK1和GSK-3β形成β-catenin磷酸化復合體，導致細胞質內游離的β-catenin積累，Wnt途徑異常激活［3］。動物實驗表明，截短突變APC基因的小鼠結腸腺癌發(fā)病率顯著升高，而保留了Axin結合位點的突變APC基因沒有產生腫瘤［4］。

1.2β-catenin

目前對于結直腸癌中基因突變情況的統(tǒng)計結果差異較大。一些學者［5-6］認為結直腸癌中β-catenin基因突變極少，只有10％左右。也有研究者認為較為普遍，約占40～50％。但絕大多數認為，在約15％APC基因未突變的結腸腺癌患者中，β-catenin基因存在點突變［7］。β-catenin基因突變后通過下面兩種方式激活Wnt途徑:①β-catenin不能被βcatenin降解復合體有效降解。當β-catenin的氨基末端與GSK-3β和CK1結合的的Ser/Thr殘基位點突變后，β-catenin磷酸化受到抑制。②β-catenin與E-cad的結合力減弱而不能被束縛在胞膜上，導致細胞質內游離的β-catenin增多。例如低劑量的次級膽酸即可誘導β-catenin的tyr殘基磷酸化，抑制β-catenin與E-cad結合［8］。

1.3c-myc和cyclin D1

β-catenin/Tcf轉錄復合體激活c-myc和cyclinD1的表達，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用［9］。研究表明在結直腸癌中，原癌基因c-myc在mRNA水平和蛋白質水平上都存在過度表達［10］。c-myc通過抑制細胞周期依賴小片蛋白激酶(cyclin-dependent kinase CDK)的抑制因子p21，促進G1/S期的進行［11］，cyclin D1則能直接激活G1期的CDK［12］。

2　泛素-蛋白酶體系與惡性腫瘤

抑癌基因p53編碼的P53蛋白在正常細胞中是不穩(wěn)定的核蛋白。它能發(fā)現DNA損傷并進行修復，如果未能完成修復，則誘導細胞凋亡，防止細胞癌變［13］。在腫瘤細胞中，p53失活一方面是由基因突變造成的，另一方面與泛素蛋白酶體對其異常的降解有關［14］。介導P53泛素化降解的是泛素結合酶UbcH8和泛素化連接酶E6-AP。E6-AP能與人乳頭瘤病毒E6癌蛋白結合形成E6-E6-AP復合物，該復合物與P53特異性結合，誘導P53降解［15］。

P27蛋白是一種細胞周期依賴性激酶抑制劑，是細胞周期中G1/S期的負調控因子之一，主要抑制cyclinD-CDK、cyclinE-CDK等激酶復合物，阻止細胞從G1期進入S期。研究發(fā)現，體內外的P27蛋白均通過泛素-蛋白酶體降解。靶向降解泛素化P27蛋白的是E3連接酶SCF(Skp1-Cullin-F-box)復合物。SCF復合物是由Skp2、Skp1、Cullin-1等亞基構成，其中Skp2是底物識別亞基。Skp2作用于磷酸化的P27，使其通過泛素蛋白酶體途徑降解［16］。癌基因c-myc可以激活泛素連接酶SCF中的Cullin基因表達，誘導SCF復合物降解P27。Masuda等［17］研究表明: Skp2與P27呈負相關，Skp2的高度表達與胃癌的不良預后相關。Yokoi等［18］研究提示，沉默Skp2基因顯著抑制肺癌細胞的生長。

β-TrCP是真核細胞中的一種F-BOX蛋白。由于β-TrCP底物功能的多樣性，β-TrCP既表現出致癌的功能，又具有抑癌的功能。在許多腫瘤細胞中都發(fā)現了β-TrCP的過表達，對結腸腺癌組織的研究發(fā)現，β-TrCP在基因水平和蛋白質水平上均與細胞的抗凋亡能力呈現正相關［19］。VHL(Von Hippel-Lindau，VHL)基因產物pVHL是E3連接酶的組成成分之一，介導缺氧誘導因子(hypoxia inducible faclor，HIF)泛素化降解，可抑制腫瘤間質血管的生成。有實驗證明，VHL基因沉默的腎細胞癌的裸鼠模型中，導入VHL基因后，腫瘤生長受到抑制［20］。Zimmer等［21］發(fā)現轉染了VHL cDNA腺病毒載體的腎癌細胞株，凋亡增加，暗示VHL與腫瘤細胞的凋亡有關。

Bromberg等［22］發(fā)現泛素連接酶RNF5在乳腺癌標本和細胞系中高標達，抑制RNF5的表達可以使腫瘤細胞生長受阻，RNF5高表達的患者生存期縮短。Chen等［23］檢測前列腺癌標本發(fā)現WWP1(一種泛素連接酶)基因表達水平顯著增強。在PC-3細胞株中，抑制WWP1基因后，細胞生長受阻。泛素連接酶HDM2在正常組織中表達很低，而在乳腺癌、軟組織肉瘤、食管癌、肺癌等腫瘤中呈高表達。HDM2靶向誘導p53泛素化降解。研究發(fā)現，通過抑制HDM2的活性可以恢復p53的功能，促進腫瘤細胞的凋亡［24］。Tsai等［25］研究發(fā)現靶向沉默泛素連接酶pg78后，肉瘤細胞系的遷移能力減弱。

3　經典Wnt通路信號分子與泛素連接酶E3

3.1β-catenin與泛素連接酶E3

繼β-catenin發(fā)現后不久，研究者發(fā)現β-catenin的轉錄后調控在Wnt信號通路的信號傳導過程中發(fā)揮著及其重要的作用。靶向降解磷酸化的βcatenin的E3連接酶β-trcP的發(fā)現，對于依賴磷酸化的泛素蛋白酶體途徑有了更深刻的認識。β-trcP 是RING家族(泛素連接酶E3)成員SCF復合物的底物識別亞基。β-trcP被磷酸化β-catenin的識別序列(DSG(X)2 + nS)識別后，SCF復合物便將泛素化多肽鏈轉移至β-catenin氨基末端的賴氨酸殘基上(Lys-19和Lys-49)，誘導其進入蛋白酶體降解途徑［26］。

3.1.1Siah-1Siah-1基因是RING家族的一員，活化的p53基因誘導Siah-1基因的表達。Siah-1蛋白一端與APC蛋白的羧基端結合，一端與β-catenin的臂重復序列結合，促使β-catenin的泛素化。Siah-1對β-catenin的泛素化修飾與β-TrCP完全不同。Siah-1既可以單獨與E2交聯酶UbcH5a53結合介導底物蛋白的泛素化，也可以與Siah-1結合蛋白(SIP)、Skp1、APC、TBL1/Ebi組成SCFTBL1復合物后再與UbcH5a53復合物結合介導泛素化。研究發(fā)現，Siah-1分子比SCFTBL1復合物對β-catenin具有更強的親和力，但是關于兩種復合物的功能和識別底物的特異性尚不清楚［27］。Siah-1與β-trcP不同，它可以識別非磷酸化的β-catenin。所以磷酸化位點發(fā)生突變的β-catenin也不能擺脫Siah-1介導的泛素蛋白酶體的調控。

3.1.2Jade-1近期研究發(fā)現，在腎細胞內E3連接酶新成員Jade-1以VHL依賴的蛋白降解機制下調細胞內β-catenin。VHL是腎癌中容易突變的一個腫瘤抑制因子，它是E3連接酶的一個亞基。在正常的腎組織中，Jade-1與VHL均高表達。與βtrcP相同，Jade-1直接與磷酸化β-catenin的N-端位點結合，但是Jade-1參與β-catenin的泛素化修飾與β-trcP的方式卻不盡相同。非洲爪蟾體內和體外實驗表明，無論Wnt通路激活還是關閉，Jade-1均可以以泛素化修飾β-catenin，調控其在胞內的水平［28］。蛋白定位分析顯示細胞核內分布有大量的Jade-1，暗示它主要調控細胞核內的β-catenin。由于Jade-1蛋白的穩(wěn)定性取決于有功能的VHL蛋白，所以在腎癌細胞中Wnt通路激活可能是由于VHL突變導致Jade-1下調［29］。Jade-1是否與Wnt通路的其他成分相關，Jade-1蛋白是否還受其他蛋白調控，在其他惡性腫瘤中是否存在VHL調控Jade-1，這些問題還有待于進一步的研究。

3.1.3β-catenin/E-cad與Hakai、Ozz-E3選擇性的泛素化降解細胞膜上與E-cad結合的β-catenin分子可以導致細胞之間粘連性減弱。E3連接酶Hakai(RING家族)可以泛素化修飾E-cadherin和β-catenin。泛素化的E-cad/β-catenin復合物通過細胞內吞作用進入胞質，細胞與細胞之間的連接損壞，細胞遷移能力增強。細胞內高表達的Hakai可能在上皮細胞向間皮細胞發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用［30］。在橫紋肌的生長過程中，E3連接酶亞基Ozz依賴細胞因子信號抑制物(suppressor of cytokine signaling，SOCS)保守區(qū)域與Elongin B/C、Cullin-5 和Rbx1等蛋白形成復合物對底物蛋白進行泛素化修飾。在肌細胞膜上，Ozz選擇性的結合β-catenin，促使其泛素化降解。所以說在肌細胞膜的形成過程中，Ozz起著至關重要的作用［31］。

3.2APC和Axin與泛素連接酶E3

研究發(fā)現，將Wnt3a基因加入到細胞內，細胞內的Axin蛋白水平降低，APC蛋白水平升高，這些暗示APC和Axin蛋白直接受Wnt通路的調控［32］。當Wnt通路激活時，誘導Axin去磷酸化。去磷酸化的Axin易被泛素蛋白酶體降解。由于Axin蛋白的缺失，APC-Axin復合物在體內大大減少。有研究者提出APC蛋白可能在Axin的降解途徑中發(fā)揮作用，但是Axin降解的作用機制還需要進一步的研究［33］。

已報道APC是泛素蛋白酶體系統(tǒng)識別的底物，因Axin蛋白過表達而降解。APC和Axin這種相互間的調控可以更有效的調控細胞內β-catenin，但是至今還未確定降解APC蛋白是哪一種E3連接酶。在細胞內，去泛素化酶(USP15)維持APC泛素化降解的動態(tài)平衡［34］。USP15是COP9信號小體(Constitutive Photomorphogenic siganlsome，CSN)復合物的亞基，CNS具有調控SCF復合物的功能。在Wnt通路中，CNS和SCFβ-TRcP復合物緊密相關。CNS復合物活化SCFβ-trcP復合物，而USP15亞基具有穩(wěn)定APC蛋白的功能，最終導致細胞內的APC-Axin復合物增多，β-catenin下調。當Wnt通路激活時，CSN復合物將從SCFβ-TRcP復合物和APC-Axin復合物中解離，導致APC泛素化降解。APC蛋白的急劇減少，促進了β-catenin在細胞內的穩(wěn)定性。

4　結論

泛素化蛋白酶體通過對Wnt通路中關鍵分子的穩(wěn)定性、受體蛋白成熟、膜蛋白運輸和蛋白質功能的調控在Wnt信號通路活化過程中發(fā)揮作用。Wnt信號通路中的關鍵分子，如β-catenin和Dvl的穩(wěn)定性受泛素連接酶E3復合物精密調控，而這些泛素連接酶復合物在不同的組織和不同的細胞中受不同的信號分子調控。人類很多疾病與泛素化修飾的底物蛋白的異常表達和基因突變有關，這些分子有可能會是治療相關疾病的分子靶標。

Wnt信號通路中的某些分子不僅是泛素化修飾的底物，而且還可以調控E3連接酶對其他底物的泛素化修飾，如APC、Axin、Dvl。這些蛋白之間的調控與被調控以及他們之間的相互作用還有待進一步的研究。Wnt信號通路中泛素化酶和去泛素化酶對底物蛋白的時空調控是如何開展?介導泛素化多肽鏈和下游靶基因的泛素結合蛋白是否與時空調控相關?所有這些疑問還有待我們進一步的研究。

泛素蛋白酶體系通過對一些癌基因和抑癌基因的調控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和腫瘤的治療方面均發(fā)揮著重大的作用。介導癌基因和抑癌基因的泛素蛋白酶體系在時空上是否具有一致性，機制本質是否有區(qū)別，也需要我們進一步的研究發(fā)現。

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(學術編輯:李祖茂)

The research on the ubiquitin proteasome system in Wnt signal pathway

ZHU Jian-jun，ZHU Xiao-hua，HUANG Ping，JIANG Hui，DENG Shi-shan

(Department of Anatomy，Basic Medical Institute，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China )

【Abstract】Wnt signal pathway is a complex system involved by a variety of molecular which are influenced，restricted and synergied by each other.It is related with the cell signal transduction，cell cycle，cell proliferation，migration and differentiation，apoptosis，adhesion and the potential differentiation ability of stem cells.Ubiquitin proteasome system plays an important role in cell activity through regulated the protein activity，subcellular localization，protein interaction，et al.The key moleculars in Wnt signal pathway，such as β-catenin，is closely regulated by ubiquitin proteasome system.The purpose of this paper is to elaborate the relationship of the Wnt signal pathway with the ubiquitin proteasome system.

【Key words】Ubiquitin proteasome system; Wnt; E3 Ligase;β-catenin

通訊作者:鄧世山，E-mail: dssgeneral@163.com

作者簡介:朱劍軍(1987-)，男，山西臨汾人，碩士，講師，主要從事結直腸腺癌發(fā)病相關基因的研究。

基金項目:四川省教育廳基金項目(13ZB0242);四川省科技廳項目(2012ZZ008)

收稿日期:2013-06-15

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.02.33

【文章編號】1005-3697(2015)02-0255-05

【中圖分類號】R362

【文獻標志碼】A

網絡出版時間: 2015-5-1 01∶33網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150501.1333.030.html