邸陽 于利 田原 林宇涵 王愛梅

熊果酸對順鉑致毒小鼠耳蝸瞬時感受器電位香草酸受體1表達的影響*

邸陽1于利1田原1林宇涵1王愛梅1

目的 研究熊果酸（ursolic acid，UA）對順鉑（cisplatin，CDDP）致毒小鼠耳蝸瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）表達的影響。方法 60只健康BALB／c小鼠隨機分成對照組（腹腔注射等量生理鹽水）、UA組（腹腔注射熊果酸80 mg／kg）、CDDP組（腹腔注射CDDP 4.5 mg／kg）和CDDP +UA組（一側腹腔注CDDP 4.5 mg／kg，同時對側腹腔注射熊果酸80 mg／kg），每組15只。各組動物均連續(xù)腹腔注射給藥5天，每天1次，給藥前及停藥后24 h行ABR檢測，然后應用免疫組織化學染色、顯微圖像分析及蛋白質印跡技術觀察小鼠耳蝸中TRPV1的表達。結果 CDDP組小鼠耳蝸TRPV1表達和ABR閾移均較對照組明顯增加（P＜0.05），UA+CDDP組小鼠ABR閾移及TRPV1表達較CDDP組明顯降低（P＜0.05），且TRPV1表達變化與ABR閾移改變高度相關（|r|＞0.7，P＜0.05）。結論 UA可抑制CDDP所致TRPV1的高表達，有效降低CDDP的耳毒性，改善聽功能。

熊果酸； 順鉑； 耳蝸； 瞬時感受器電位香草酸受體1

網(wǎng)絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20140911.0902.014.html

瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是瞬時感受器電位（transient receptor potential，TRP）通道家族成員之一，可在哺乳動物耳蝸中表達，參與耳蝸的敏感性調(diào)節(jié)，維持耳蝸內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡［1，2］。近年來的研究表明，耳毒性藥物順鉑（cisplatin，CDDP）可誘導TRPV1在耳蝸中高表達，進而促進活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過量生成并進一步引發(fā)脂質過氧化，最終導致聽力損失［3］。熊果酸（ursolic acid，UA）是一種在植物界分布較廣的三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎等多種作用［4，5］，臨床上已用于治療病毒性肝炎并取得較好療效。然而，UA是否也能有效防護CDDP的耳毒性，以及其防護作用是否與TRPV1有關，目前尚不明確。因此，本研究擬通過觀察UA對CDDP致毒小鼠耳蝸TRPV1表達的影響，探討UA對CDDP耳毒性的防護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物為健康BALB／c小鼠60只，體重20～25 g，雌雄不限，耳廓反射正常，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供；UA購自南京譯朗醫(yī)藥科技有限公司；兔抗TRPV1多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自英國Abcam公司；預染蛋白Marker購于美國NEB公司；Smart EP＆OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)由美國IHS公司生產(chǎn)；Mini-PROTEAN蛋白電泳儀和Trans-Blot SD半干轉印槽由美國BIO-RAD公司生產(chǎn)；IBOX-600全自動凝膠成像系統(tǒng)由美國UVP公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 將60小鼠隨機分成對照組、UA組、CDDP組和CDDP+UA組，每組15只（30耳）。CDDP組腹腔注射順鉑4.5 mg／kg［6］，UA組腹腔注射熊果酸80 mg／kg，CDDP+ UA組腹腔注射順鉑4.5 mg／kg，同時在對側腹腔注射熊果酸80 mg／kg，對照組腹腔注射等量生理鹽水；四組動物均連續(xù)給藥5 d，每天1次。

1.2.2 ABR測試 各組動物于給藥前及停藥后24 h分別測試ABR。應用聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音（tone burst）刺激，重復率39.1次／秒，帶通濾波100～1 500 Hz，疊加1 024次，掃描時程16.0 ms。聲刺激強度從95 dB SPL開始，以3 d B逐次遞減，以剛出現(xiàn)ABR波Ⅰ并至少重復兩次的最小聲刺激強度判定為反應閾，記錄8、12和24 k Hz三個頻率的ABR反應閾值；根據(jù)同一刺激頻率下給藥前后的反應閾差值計算ABR閾移［7］。

1.2.3 耳蝸石蠟切片標本制備 待各組動物停藥并測試完ABR后，每組任取6只小鼠立即斷頭處死，速取聽泡。充分暴露耳蝸后，顯微鏡下刺破圓窗和卵圓窗，蝸尖鉆孔并緩慢灌流含4%多聚甲醛的0.1 mol／L PBS（p H 7.4），并將標本浸入該固定液中4℃下24 h；經(jīng)PBS沖洗后放入4%EDTA中，4℃下脫鈣3～5 d。標本經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋后，沿蝸軸正中行5μm連續(xù)切片。

1.2.4 免疫組織化學染色 耳蝸切片60℃下烘烤1 h后，常規(guī)脫蠟至水；PBS浸泡5 min，EDTA修復液高壓修復2 min；3%H2O2孵育10 min后，以正常血清封閉液室溫下孵育切片15 min，然后滴加抗TRPV1抗體（1：200稀釋），4℃過夜；取出切片用PBS沖洗后，滴加二抗，37℃孵育15 min；PBS沖洗后滴加SABC復合物，37℃孵育15 min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察結果并照相。對照染色切片用PBS代替一抗，其他步驟不變。TRPV1陽性反應產(chǎn)物呈棕黃色顆粒。

1.2.5 顯微圖像分析 每組隨機取10張圖片，應用Image-Pro Plus 6.0軟件在同等條件下測量各組耳蝸外毛細胞（outer hair cell，OHC）TRPV1陽性反應產(chǎn)物的光密度值。光密度值越大，表示陽性反應越強烈。

1.2.6 蛋白質印跡檢測 完成ABR測試后，將各組剩余9只小鼠立即斷頭處死，速取聽泡。體視顯微鏡下取出雙側耳蝸組織，向標本中加入RIPA裂解液，15 min后4℃下離心10 min（12 000rpm／min）；取上清并測定蛋白含量。灌膠后上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，加入含10%牛血清白蛋白封閉液，37℃下?lián)u床孵育1 h；加入抗TRPV1抗體（1：1 000稀釋），4℃過夜；TBST（Tris-Buffered Saline and Tween 20）洗滌緩沖液沖洗后，加入辣根過氧化物酶標記二抗（1：2 000稀釋），4℃下?lián)u床孵育1 h，TBST沖洗后滴加ECL化學發(fā)光劑，即可見成像條帶；采用全自動凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶進行分析，讀取各電泳條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照物，TRPV1／β-actin比值代表TRPV1的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組之間數(shù)據(jù)比較均采用單因素方差分析及LSD檢驗，另對CDDP組和CDDP+UA組TRPV1陽性反應的平均光密度值與ABR閾移的關系做直線相關檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠ABR閾移比較 由表1可見，CDDP組小鼠各頻率ABR閾移較對照組明顯增大（P＜0.01），CDDP+UA組小鼠ABR閾移較CDDP組明顯減?。≒＜0.05），UA組與對照組小鼠ABR閾移無明顯差異。

2.2 各組小鼠耳蝸TRPV1表達比較

2.2.1 各組免疫組織化學染色結果 光鏡下可見對照組小鼠耳蝸OHC中TRPV1的陽性染色較弱（圖1a），UA組的陽性染色與對照組基本相同（圖1b），而CDDP組的陽性染色較對照組明顯加深（圖1c），CDDP+UA組的陽性染色則較CDDP組明顯減弱（圖1d）；顯微圖像分析結果顯示，對照組TRPV1陽性反應的平均光密度值為0.04±0.01，而CDDP組的平均光密度值為0.41±0.07，明顯高于對照組（P＜0.01）；CDDP+UA組TRPV1陽性反應的平均光密度值（0.22±0.02）較CDDP組明顯減?。≒＜0.01），UA組的平均光密度值為0.05± 0.01，與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠各頻率ABR閾移（dB，±s，n＝30耳）

表1 各組小鼠各頻率ABR閾移（dB，±s，n＝30耳）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CDDP組比較，＃P＜0.01

圖1 各組小鼠耳蝸底回OHC TRPV1的表達

2.2.2 各組蛋白質印跡檢測結果 對照組和UA組小鼠耳蝸TRPV1的電泳條帶較弱，而CDDP組小鼠耳蝸TRPV1的電泳條帶明顯深于對照組；CDDP+UA組小鼠耳蝸TRPV1的電泳條帶則較CDDP組明顯減弱（圖2）。半定量分析結果顯示，對照組TRPV1／β-actin比值為0.09±0.01，而CDDP組為0.67±0.03，明顯高于對照組（P＜0.05）；CDDP+UA組TRPV1／β-actin比值為0.29±0.01，較CDDP組明顯減?。≒＜0.01），UA組TRPV1／β -actin比值為0.09±0.01，與對照組相同。

圖2 各組小鼠耳蝸TRPV1電泳條帶

2.3 CDDP組和CDDP+UA組小鼠TRPV1陽性反應的平均光密度值與ABR閾移的關系 直線相關檢驗結果顯示，小鼠耳蝸TRPV1陽性反應的平均光密度值與各刺激頻率下ABR閾移均顯著相關（P＜0.05或P＜0.01），表明TRPV1表達越強，ABR閾移越大（表2）。

表2 CDDP組和CDDP+UA組小鼠耳蝸OHC中TRPV1陽性反應的平均光密度值與ABR閾移的相關系數(shù)

3 討論

目前認為，順鉑所致聽力損失與其誘導耳蝸細胞凋亡密切相關，而活性氧（ROS）在誘導耳蝸細胞凋亡的過程中發(fā)揮了重要作用。近年來的研究［8］表明，順鉑可誘導TRPV1在耳蝸中的高表達，進而促進ROS的過量生成并進一步引發(fā)脂質過氧化，從而產(chǎn)生高毒性的脂質過氧化產(chǎn)物4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE），隨后導致耳蝸細胞凋亡，聽力損失。另有研究［3，6］顯示，順鉑通過誘導TRPV1高表達，引起Ca2+內(nèi)流和超載，超載的Ca2+再激活中性半胱氨酸蛋白酶（calpain），進而降解細胞骨架、膜蛋白以及各種激酶，最終導致耳蝸細胞凋亡。

TRPV1是TRPV亞家族中首個被克隆的通道蛋白，也是目前研究最多的TRP家族成員之一［9］，近年來發(fā)現(xiàn)，TRPV1在介導耳蝸病理生理學過程等方面具有重要作用［10～12］。Mukherjea等［10］觀察到鼓室內(nèi)注射TRPV1激動劑辣椒素24 h后，可造成大鼠聽覺暫時性閾移；Ishibashi等［11］報道經(jīng)慶大霉素（gentamicin，GM）處理后的小鼠耳蝸毛細胞中TRPV1的表達明顯增強；Lee等［12］也證實GM可通過TRPV1進入新生大鼠耳蝸毛細胞中，從而對耳蝸毛細胞造成損傷。由此表明，TRPV1介導了GM的耳毒性。本研究結果顯示，給小鼠連續(xù)5天腹腔注射CDDP后，CDDP組小鼠耳蝸OHC中TRPV1的表達較對照組明顯增強，并且與ABR閾移增大高度相關，表明TRPV1也參與了CDDP的耳毒性。

UA又名烏索酸、烏蘇酸，廣泛分布于熊果、陸英、山楂等60余種植物中，具有很強的抗氧化作用，近年來已受到國際醫(yī)藥學界的高度重視。研究表明，UA可通過抑制ROS生成、DNA斷裂等機制，有效防護β-淀粉樣肽對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma-derived cell line，PC）12細胞的神經(jīng)毒性效應［13］。Yu等［14］觀察到，UA可通過抑制脂質過氧化和增強過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物的活性，從而有效防護過氧化氫對耳蝸毛細胞株（house ear institue，organ of corti 1，HEI-OCI）的毒性效應；最近研究顯示，UA可有效抑制TRPV1的激活，從而發(fā)揮止咳作用［15］。本研究觀察到CDDP+UA組小鼠耳蝸OHC中TRPV1的陽性表達明顯弱于CDDP組，同時該組小鼠ABR閾移也顯著減小，并且與TRPV1表達下調(diào)高度相關；蛋白質印跡檢測結果也顯示CDDP+UA組小鼠耳蝸TRPV1蛋白表達水平較CDDP組明顯降低，表明UA可顯著抑制CDDP所致TRPV1的高表達，從而有效拮抗CDDP的耳毒性，改善聽功能。

綜上所述，TRPV1介導了CDDP對BALB／c小鼠的耳毒性損傷，UA可抑制CDDP所致TRPV1的高表達；UA組小鼠ABR閾移和TRPV1表達均與對照組無明顯差別，表明UA安全無毒，具有良好的臨床應用前景。UA可下調(diào)CDDP致毒小鼠耳蝸TRPV1表達的具體機制有待于今后更深入的研究。

1 Zheng J，Dai C，Steyger PS，et al.Vanilloid receptors in hearing：altered cochlear sensitivity by vanilloids and expression of TRPV1 in the organ of corti［J］.J Neurophysiol，2003，90：444.

2 才巖，王愛梅，于利，等.瞬時受體電位通道蛋白A1和V1在正常小鼠耳蝸中的定位表達［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2012，22：1.

3 Mukherjea D，Jajoo S，Whitworth C，et al.Short interfering RNA against transient receptor potential vanilloid 1 attenuates cisplatin-induced hearing loss in the rat［J］.J Neurosci，2008，28：13056.

4 Tsai SJ，Yin MC.Antioxidative and anti-inflammatory protection of oleanolic acid and ursolic acid in PC12 cells［J］.J Food Sci，2008，73：174.

5 Checker R，Sandur SK，Sharma D，et al.Potent anti-inflammatory activity of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，is mediated through suppression of NF-κB，AP-1 and NFAT［J］.PLoS One，2012，7：e31 318.

6 Chang L，Wang AM.Calpain mediated cisplatin-induced ototoxicity in mice［J］.Neural Regen Res，2013，8：1 995.

7 Wang AM，Hou N，Bao DY，et al.Mechanism of alpha-lipoic acid in attenuating kanamycin-induced ototoxicity［J］. Neural Regen Res，2012，7：2793.

8 Lee JE，Nakagawa T，Kim TS，et al.Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment［J］.Acta Otolaryngol，2004，124：1131.

9 Ho KW，Ward NJ，Calkins DJ.TRPV1：a stress response protein in the central nervous system［J］.Am J Neurodegener Dis，2012，1：1.

10 Mukherjea D，Jajoo S，Sheehan K，et al.NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss［J］.Antioxid Redox Signal，2011，14：999.

11 Ishibashi T，Takumida M，Akagi N，et al.Changes in transient receptor potential vanilloid（TRPV）1，2，3 and 4 expression in mouse inner ear following gentamicin challenge［J］.Acta Otolaryngol，2009，129：116.

12 Lee JH，Park C，Kim SJ，et al.Different uptake of gentamicin through TRPV1 and TRPV4 channels determines cochlear hair cell vulnerability［J］.Exp Mol Med，2013，45：e12.

13 Hong SY，Jeong WS，Jun M.Protective effects of the key compounds isolated from corni fructus againstβ-amyloidinduced neurotoxicity in PC12 Cells［J］.Molecules，2012，17：10831.

14 Yu HH，Hur JM，Seo SJ，et al.Protective effect of ursolic acid from Cornus officinalis on the hydrogen peroxide-induced damage of HEI-OC1 auditory cells［J］.Am J Chin Med，2009，37：735.

15 Zhang Y，Sreekrishna K，Lin Y，et al.Modulation of transient receptor potential（TRP）channels by Chinese herbal extracts［J］.Phytother Res，2011，25：1666.

（2014-04-16收稿）

（本文編輯 李翠娥）

The Effects of UrsoIic Acid on CispIatin-Induced Expression of Transient Receptor PotentiaI VaniIIoid 1 in Mouse CochIea

Di Yang，Yu Li，Tian Yuan，Lin Yuhan，Wang Aimei
（Department of physioIogy，Liaoning MedicaI University，Jinzhou，121001，China）

Objective To investigate the effects of ursolic acid（UA）on cisplatin（CDDP）-induced expression of transient receptor potential vanilloid 1（TRPV1）in mouse cochlea.Methods Sixty BALB／c mice were randomly divided into 4 groups（15 mice in each group）and

introperitoneal injection once daily for 5 days：Control group（normol saline），UA group（80 mg／kg／day），CDDP group（4.5 mg／kg／day），and CDPP（4.5 mg／kg／day）plus UA group（80 mg／kg／day）.The expression of TRPV1 in mouse cochlea was determined by immunohistochemistry，microscope image analysis and western blot，and auditory thresholds were evaluated by auditory brainstem response（ABR）measurement.ResuIts The expression of cochlea TRPV1 and ABR threshold shift was significantly increased in the mice treated with CDDP（P＜0.05），as compared with control mice.These effects were prevented by UA treatment（all P＜0.05）.Furthermore，a linear relationship analysis revealed that the expression of cochlea TRPV1 was significantly correlated with ABR threshold shift（|r|＞0.7，P＜0.05）.ConcIusion

UA effectively attenuated CDDP-induced ototoxicity and improved auditory function through inhibition of TRPV1.

Ursolic acid； Cisplatin； Cochlea； Transient receptor potential vanilloid 1

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.01.014

時間：2014-9-11 9：02

R764.43

A

1006-7299（2015）01-0057-04

* 遼寧省科學技術計劃項目（2011225015）

1 遼寧醫(yī)學院生理學教研室（錦州 121001）

邸陽，男，遼寧人，講師，碩士在讀，研究方向：聽覺生理與病理。

王愛梅（Email：aimeiwang88@163.com）

·聽力康復·