張　誠，劉艷輝

(四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，成都 610041)

側(cè)裂區(qū)低級別腦膠質(zhì)瘤中MMP家族水平的檢測及其與預(yù)后情況分析

張誠※，劉艷輝

(四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，成都 610041)

摘要：目的研究側(cè)裂區(qū)低級別腦膠質(zhì)瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族水平的檢測及其與預(yù)后情況的相關(guān)性。方法將2007年1月至2010年12月四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的130例側(cè)裂區(qū)Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者作為觀察組，選擇同期收治的30例顱腦損傷患者作為對照組，檢測組織中MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平，并隨訪觀察組患者的預(yù)后情況。結(jié)果觀察組患者腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的mRNA水平分別為233±35、253±32，均高于對照組的100±15、100±19，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；觀察組患者腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的蛋白陽性率分別為63.8%(83/130)、62.3%(81/130)，均高于對照組的13.3%(4/30)、16.7%(5/30),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MMP-2、MMP-9陽性患者的無瘤生存時間短于陰性患者，1年復(fù)發(fā)率、3年復(fù)發(fā)率高于陰性患者(P<0.05)；MMP-2、MMP-9是膠質(zhì)瘤患者1年復(fù)發(fā)(OR=2.275，2.311)、3年復(fù)發(fā)(OR=2.291，2.541)的危險因素。MMP-2、MMP-9陽性患者的無瘤生存時間短于陰性患者(P<0.05)，1年復(fù)發(fā)率、3年復(fù)發(fā)率高于陰性患者(P<0.05)；MMP-2、MMP-9是膠質(zhì)瘤患者1年復(fù)發(fā)、3年復(fù)發(fā)的危險因素。結(jié)論MMP-2、MMP-9的表達(dá)與側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，MMP-2、MMP-9陽性患者的遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率較高。

關(guān)鍵詞：腦膠質(zhì)瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶；復(fù)發(fā)

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)的常見腫瘤，其本身的致瘤性和侵襲性會對患者的神經(jīng)功能造成較大損害，且手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)率較高[1]。側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤是圍繞外側(cè)裂區(qū)域生長的一類膠質(zhì)瘤，該區(qū)域血管分支豐富、供應(yīng)范圍較廣，手術(shù)切除難度較大，且術(shù)后復(fù)發(fā)后的處理也十分棘手[2]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤性生長是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的最根本原因，腫瘤浸潤的過程與基膜降解、血腦屏障破壞密不可分?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族是一類參與細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤組織侵襲的蛋白酶類物質(zhì)，且與腦膠質(zhì)瘤的浸潤過程密切相關(guān)[3]。本研究從患者遠(yuǎn)期預(yù)后的角度分析側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤中MMP家族的表達(dá)量及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2007年1月至2010年12月四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的130例側(cè)裂區(qū)Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者作為觀察組，患者均符合側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)，收住院后進(jìn)行顯微手術(shù)切除治療，其中男73例、女57例，年齡39～62歲，平均(47±6)歲。將同期收治的30例顱腦損傷患者作為對照組，患者收住院后接受減壓手術(shù)，其中男17例、女13例，年齡35～66歲，平均(48±7)歲。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑免疫組織化學(xué)試劑盒和常規(guī)試劑購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體購買于Abcam公司；RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測試劑購買于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3方法

1.3.1聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法取組織采用天根生化科技(北京)有限公司的mRNA抽提試劑盒提取mRNA，而后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒檢測mRNA水平，擴(kuò)增體系：cDNA 2 μL、含染料的反應(yīng)液 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、去離子水7.0 μL，擴(kuò)增調(diào)節(jié)：95 ℃、15 s、特異性退火溫度、25 s，72 ℃、35 s。分別擴(kuò)增看家基因actin及目的基因MMP-2、MMP-9，設(shè)定對照組血清中目的基因mRNA的水平為100，通過ΔΔCt計算對照組血清中目的基因的mRNA水平。

1.3.2免疫組織化學(xué)法腦組織固定于4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋后以蠟塊形式保存。檢測時，連續(xù)切片后制作石蠟切片，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，逐步脫蠟至水，滴加1∶300的MMP-2和MMP-9第一抗體，4 ℃濕盒孵育過夜，而后滴加Envision 第二抗體，37 ℃濕盒孵育30 min。最后顯色、沖洗、復(fù)染、封片，鏡下觀察。陽性染色細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色，MMP-2 和MMP-9陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)。免疫組織化學(xué)陽性評價標(biāo)準(zhǔn)[4]：無陽性細(xì)胞為“-”、陽性細(xì)胞計數(shù)≤25%為“+”、陽性細(xì)胞計數(shù)>25%～50%為“++”、陽性細(xì)胞計數(shù)>50%為“+++”?！?”和“+”判斷為基因表達(dá)陰性，“++”“+++”判斷為基因表達(dá)陽性。

1.3.3隨訪方法隨訪開始時間為側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤手術(shù)當(dāng)日，隨訪截止時間為2013年12月。隨訪形式：門診隨訪、電話隨訪、家庭訪視。隨訪內(nèi)容包括腫瘤復(fù)發(fā)情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況和存活情況。

2結(jié)果

2.1兩組患者M(jìn)MP-2和MMP-9的表達(dá)情況觀察組患者腫瘤組織中MMP-2和MMP-9的mRNA水平高于對照組，蛋白陽性率也高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　兩組患者腦組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況

MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；觀察組：側(cè)裂區(qū)Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者；對照組：顱腦損傷患者；a為t值，余為χ2值

2.2膠質(zhì)瘤患者預(yù)后情況的單因素分析MMP-2、MMP-9陽性患者的無瘤生存時間短于陰性患者，1年復(fù)發(fā)率、3年復(fù)發(fā)率高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　膠質(zhì)瘤患者預(yù)后情況的單因素分析結(jié)果

MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

2.3膠質(zhì)瘤患者1年復(fù)發(fā)情況的Cox回歸分析對1年復(fù)發(fā)情況進(jìn)行Cox回歸分析，采用向后篩選法，MMP-2、MMP-9均納入方程，結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9是膠質(zhì)瘤患者1年復(fù)發(fā)的危險因素(OR=2.275，2.311)。見表3。

表3　膠質(zhì)瘤患者1年復(fù)發(fā)的多因素Cox回歸分析

MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

2.4膠質(zhì)瘤患者3年復(fù)發(fā)情況的Cox回歸分析對3年復(fù)發(fā)情況進(jìn)行Cox回歸分析，采用向后篩選法，MMP-2、MMP-9均納入方程，結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9是膠質(zhì)瘤患者3年復(fù)發(fā)的危險因素(OR=2.291，2.541)。見表4。

表4　膠質(zhì)瘤患者3年復(fù)發(fā)的多因素Cox回歸分析

MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

3討論

側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤是指圍繞外側(cè)裂區(qū)域生長的腦膠質(zhì)瘤，多累及額葉、顳葉、導(dǎo)葉、頂葉以及基底節(jié)、丘腦。側(cè)裂區(qū)內(nèi)血管豐富，分支供應(yīng)的范圍較廣，包括軀體的運動中樞、感覺中樞、語言中樞的血供均來自側(cè)裂區(qū)內(nèi)的血管，這就給手術(shù)帶來了極大的難度。近年來，隨著顯微手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，側(cè)裂區(qū)膠質(zhì)瘤的切除效果得到了明顯的改善[5]。但由于膠質(zhì)瘤本身的致瘤性和侵襲性，患者在手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)率較高，多數(shù)患者在接受手術(shù)、放化療等綜合治療后仍在3年內(nèi)再次發(fā)生膠質(zhì)瘤[6]。膠質(zhì)瘤最重要的生物學(xué)特性是浸潤性生長，這也是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)的根本原因[7]。

MMP家族是一類含有Zn2+的蛋白水解酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑、改型和降解，參與腫瘤新生血管的形成以及向周圍的侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。迄今為止，已被研究和發(fā)現(xiàn)的MMP超過了20種，Sun等[9]研究認(rèn)為，MMP家族的活化是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵限速步驟。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者腫瘤組織中MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白陽性率均高于對照組，提示MMP-2和MMP-9的過度表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

在此基礎(chǔ)上，本研究還對側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后情況進(jìn)行了單因素分析，結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9陽性患者的無瘤生存時間短于陰性患者，1年復(fù)發(fā)率、3年復(fù)發(fā)率高于陰性患者，提示腫瘤組織中MMP的表達(dá)可以影響患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。隋銳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤組織中，MMP-2和MMP-9的mRNA水平、蛋白水平均顯著升高；而Jung等[11]在體外培養(yǎng)的細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)，MMP降解層粘連蛋白后可產(chǎn)生具有催化活性的可溶性片段，參與腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)、遷移和侵襲過程等。

近年來，越來越多的臨床學(xué)者開始關(guān)注膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為及其分子機(jī)制，也逐步認(rèn)識到膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為受多種分子機(jī)制的同時作用[12]。這也意味著膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后情況受到多種因素的共同影響，不能僅用一種分子或一種蛋白對疾病的預(yù)后進(jìn)行一元化解釋?；谝陨蠁我蛩胤治龅慕Y(jié)果，本研究初步推測MMP-2、MMP-9的表達(dá)與患者的無瘤生存、腫瘤復(fù)發(fā)情況密切相關(guān)。為了進(jìn)一步明確兩種MMP分子在膠質(zhì)瘤患者遠(yuǎn)期預(yù)后中的作用，進(jìn)一步進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9膠質(zhì)瘤患者是1年和3年復(fù)發(fā)的危險因素。

綜上所述，MMP-2、MMP-9的表達(dá)與側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，MMP-2、MMP-9陽性患者的遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率較高。

參考文獻(xiàn)

[1]劉偉，王長坤，只達(dá)石，等.MMP2、MMP9在人腦膠質(zhì)瘤及其浸潤組織中的表達(dá)和臨床意義[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2009，26(6)：689-692.

[2]李海濤，王文，肖淳，等.小腦幕切開對緩解側(cè)裂區(qū)膠質(zhì)瘤術(shù)后腦水腫及降低顱內(nèi)壓的相關(guān)性研究[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2013，39(3)：162-165.

[3]陳靜，盧明，彭立輝，等.側(cè)裂區(qū)腦膠質(zhì)瘤的顯微手術(shù)治療[J].山東醫(yī)藥，2010，50(2)：42-43.

[4]Ma C,Li Y,Zhang X,etal.Levels of vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase-9 proteins in patients withglioma[J].J Int Med Res,2014,42(1):198-204.

[5]Erdem H,Yildirim U,Uzunlar AK,etal.Relationship among expression of basic-fibroblast growth factor,MTDH/astrocyte elevated gene-1,adenomatous polyposis coli,matrix metalloproteinase 9,and COX-2 markers with prognostic factors in prostate carcinomas[J].Niger J Clin Pract,2013,16(4):418-423.

[6]吳建珩，李曉輝，吳世陶，等.ARK5和MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，30(7)：594-597.

[7]李秋陽，陳惠麗，李寧，等.MMP-9和PTEN蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特點及意義[J].中國實驗診斷學(xué)，2013，17(10)：1811-1814.

[8]Xu Y,Zhong Z,Yuan J,etal.Collaborative overexpression of matrix metalloproteinase-1 and vascular endothelial growth factor-C predicts adverse prognosis in patients with gliomas[J].Cancer Epidemiol,2013,37(5):697-702.

[9]Sun C,Wang Q,Zhou H,etal.Antisense MMP-9 RNA inhibits malignant glioma cell growth in vitro and in vivo[J].Neurosci Bull,2013,29(1):83-93.

[10]隋銳，張燁，陳一，等.MMP-2及MMP-9聯(lián)合檢測在腦膠質(zhì)瘤中的診斷價值[J].中國實驗診斷學(xué)，2014，18(2)：205-206.

[11]Jung CH,Kim EM,Park JK,etal.Bmal1 suppresses cancer cell invasion by blocking the phosphoinositide 3-kinase-Akt-MMP-2 signaling pathway[J].Oncol Rep,2013,29(6):2109-2113.

[12]Maddirela DR,Kesanakurti D,Gujrati M,etal.MMP-2 suppression abrogates irradiation-induced microtubule formation in endothelial cells by inhibiting αvβ3-mediated SDF-1/CXCR4 signaling[J].Int J Oncol,2013,42(4):1279-1288.

Detection of MMP Family Levels in Lateral Fissure Area Low Grade Glioma and PrognosisZHANGCheng，LIUYan-hui.(DepartmentofNeurosurgery,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract:ObjectiveTo study the levels of matrix metalloproteinase(MMP) family in lateral fissure area low grade glioma and its correlation with prognosis.MethodsTotal of 130 patients with lateral fissure area gradeⅠ and Ⅱ glioma in West China Hospital of Sichuan University from Jan.2007 to Dec.2010 were enrolled in observation group and another 30 brain injury patients in the same period were enrolled in control group.Then mRNA and protein levels of MMP-2,MMP-9 were detected,and the prognosis were followed up.ResultsmRNA levels of MMP-2,MMP-9 in tumor tissue of the observation group were 233±35 and 253±32,higher than the control group(100±15 and 100±19),the differences were statistically significant(P<0.05).The positive rate of MMP-2,MMP-9 protein in tumor tissue of the observation group were 63.8%(83/130) and 62.3%(81/130),which were higher than the control group[13.3%(4/30) and 16.7%(5/30)],the differences were statistically significant(P<0.05).Tumor free survival time of MMP-2,MMP-9 positive patients was shorter than negative patients,and the 1-year and 3-year recurrence rate were higher than the negative patients(P<0.05).MMP-2 and MMP-9 were risk factors of 1-year recurrence(OR=2.275,2.311)and 3-year recurrence(OR=2.291,2.541).ConclusionMMP-2 and MMP-9 expression are closely correlated with prognosis of lateral fissure area glioma patients;long-term recurrence rate of MMP-2,MMP-9 positive patients is higher.

Key words:Glioma; Matrix metalloproteinase; Recurrence

收稿日期：2014-09-09修回日期：2015-02-07編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.051

中圖分類號：R739.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)17-3210-03