王 慧，馬 玲，孟慶坤，崔榮林

(1．東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040;

2．黑龍江省七臺(tái)河市林業(yè)局，黑龍江七臺(tái)河154600)

α-蒎烯是多種植物精油活性成分的重要組成部分，具有很強(qiáng)的抑菌性、殺蟲(chóng)活性，是植物揮發(fā)性有機(jī)化合物［1－3］。α-蒎烯以及含有α-蒎烯的植物精油對(duì)儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)、大田害蟲(chóng)、森林害蟲(chóng)和某些病菌均具有較強(qiáng)的生物活性。在綜合防治有害生物的領(lǐng)域中，α-萜品醇有著重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的綜合利用空間，其對(duì)有害生物的作用機(jī)理可為有害生物綜合治理提供新的方法和理論依據(jù)。

外源物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響最初是從個(gè)體分子開(kāi)始，然后在細(xì)胞、器官、個(gè)體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)等各個(gè)層面上逐步表現(xiàn)出來(lái)，是現(xiàn)代毒理學(xué)的觀點(diǎn)［4］。目前，利用農(nóng)藥對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)SOD、POD、CAT等產(chǎn)生的影響，已在農(nóng)藥評(píng)價(jià)中得到廣泛的應(yīng)用和良好的驗(yàn)證。因此，研究α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)體內(nèi)生物化學(xué)標(biāo)志物(SOD、POD、CAT)的影響，明確該種外源物濃度與主要酶活性的關(guān)系，對(duì)于研究其對(duì)昆蟲(chóng)的致毒機(jī)理具有重要意義。為此，筆者采用熏蒸法測(cè)定了α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的急性毒性，并測(cè)定了對(duì)其體內(nèi)SOD、POD、CAT 3種酶活性的影響，旨在為研究α-蒎烯的殺蟲(chóng)活性與作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試藥劑。α-蒎烯購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1．1．2 供試?yán)ハx(chóng)。黃粉蟲(chóng)(Tenebrio molitor)和麥麩均購(gòu)自黑龍江哈爾濱市大發(fā)花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)，將黃粉蟲(chóng)置于(23±2)℃、相對(duì)濕度70%的生化培養(yǎng)箱中以麥麩喂養(yǎng)，馴化15 d后挑選大小一致、健康的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)供試驗(yàn)用。

1．1．3 試劑。購(gòu)自Amresco公司的包括苯甲基磺酰氟(PMSF)、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、核黃素、還原型谷胱甘肽、對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉等;購(gòu)自Sigma公司的包括毒扁豆堿、固藍(lán)B鹽，1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)等;購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所的有愈創(chuàng)木酚;購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的有過(guò)氧化氫、α-乙酸萘酯、硝基氮藍(lán)四唑、L-甲硫氨酸、苯酚等。1．1．4 儀器。玻璃勻漿器(黑龍江省譽(yù)航科學(xué)器材有限公司)、HPG-400BX 400HX光照培養(yǎng)箱(黑龍江哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、TH-500BQ超聲波清洗儀(山東濟(jì)寧天華超聲波電子儀器有限公司)、Cary 100/300雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 急性毒力測(cè)定。采用廣口瓶密閉熏蒸法［5］。

1．2．2 致毒處理設(shè)置。以 α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)48 h的LC50為基準(zhǔn)［6］，用蒸餾水配制 LC20，設(shè)置不施藥的 12、24、36、48 h黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)為空白對(duì)照，選取健康、大小、顏色一致的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)，每組100頭，每濃度處理3次重復(fù)。處理后12、24、36、48 h分別從每個(gè)濃度處理中隨機(jī)挑選10頭幼蟲(chóng)作為樣本，存放于－80℃冰箱中，供酶活性測(cè)定。

1．2．3 酶液制備。隨機(jī)選取經(jīng)過(guò)藥劑處理的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)10頭，加預(yù)冷的提取液5 ml，并置于玻璃勻漿器內(nèi)冰浴，再充分勻漿，然后采用4℃高速離心，上清液即酶液。SOD、POD、CAT所用勻漿液和離心參數(shù)如下:勻漿液為0．05 mol/L PBS，離心力為 15079 ×g，離心 30 min［7］。

1．2．4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定。參照Bradford(1976)的考馬斯亮藍(lán) G-250 法［8］。

1．2．5 昆蟲(chóng)體內(nèi)酶活性測(cè)定。

1．2．5．1 SOD 活性測(cè)定。參照 Beauchamp 等的方法［9］，略有改進(jìn)。3．0 ml反應(yīng)液［含 50．0 mmol/L PBS(pH7．8)，13．0 mmol/L Met，0．1 mmol/L EDTA，75 μmol/L NBT］，加入25 μl粗酶液，最后加入0．6 ml 0．5 mmol/L核黃素，以不加酶液管作為最大光還原管，在25℃光照培養(yǎng)箱中三級(jí)光照下(4 000 lx)處理15 min后立即避光測(cè)定OD560值。

1．2．5．2 POD 活性測(cè)定。參照 Simon 等的方法［10］，略有改進(jìn)。3．0 ml反應(yīng)體系中含100．0 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)、30．0 mmol/L 愈創(chuàng)木酚、26．0 mmol/L 過(guò)氧化氫和150.0 mmol/L酶液，反應(yīng)5 min，在470 mm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1．2．5．3 CAT 活性測(cè)定。參照Cohen 方法［11］。取0．5 ～0．6 ml 30% 過(guò)氧化氫，加水至 50 ml，從中取出 4．0 ml，加入 26．0 ml 0．05 mol/L PBS(pH 7．0)，測(cè)定240 nm 波長(zhǎng)處的 OD 值，如其OD值在0．50～0．55，即作為CAT的底物溶液，再取3．0 ml配制的底物溶液，并在25℃下加入20μl粗酶液，然后立即用紫外分光光度計(jì)在240 nm波長(zhǎng)下每隔30 s讀一次，記錄3 min。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理。用Excel繪圖。運(yùn)用SPSS16．0軟件中的Duncan’s方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力 由表1可知，α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng) 12、24、36 和 48 h 的 LC50分別為 101．434、67.518、57．810 和44．120 μg/L，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng) LC50逐漸降低，表明α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)的毒性作用隨時(shí)間的增加而逐漸加強(qiáng)。選擇α-蒎烯48 h的LC50和LC20作為處理濃度，測(cè)定α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)7種酶的影響。為反應(yīng)遲鈍，用探針輕觸后不能正常反應(yīng)，從癥狀來(lái)看應(yīng)該是麻醉后又蘇醒的幼蟲(chóng)。

表1 α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力

2．3 α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的影響 由圖1可知，黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)經(jīng) LC20、LC50濃度的 α-蒎烯處理 12、24、36、48 h后，體內(nèi)SOD酶活性均顯著低于對(duì)照。LC20、LC50濃度的α-蒎烯最大抑制率分別出現(xiàn)在36和48 h，最大抑制率分別為對(duì)照的50．96%和49．48%。

2．2 中毒癥狀 在熏殺試驗(yàn)中觀察到，在接入廣口瓶初期幼蟲(chóng)均表現(xiàn)出不同程度的興奮癥狀，如翻滾、跳躍、快速爬行等;隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，幼蟲(chóng)行動(dòng)都漸趨緩慢，直至靜止不動(dòng)(也有被麻醉的可能性)。經(jīng)過(guò)12、24、36、48 h后分別觀察記錄，處理組的部分幼蟲(chóng)出現(xiàn)蟲(chóng)體變黑，抽搐、痙攣的現(xiàn)象，并且偶有吐水的現(xiàn)象，蟲(chóng)體失水變軟、萎縮，最后直至死亡;處理組的少部分幼蟲(chóng)被麻醉但沒(méi)有完全死亡，活動(dòng)緩慢且行

2．4 α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)體內(nèi)POD活性的影響 由圖2可知，黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)經(jīng) LC20、LC50濃度的 α-蒎烯處理 12、24、36、48 h后，除LC20、LC50濃度的α-蒎烯12 h酶活性高于對(duì)照外，體內(nèi)POD酶活性均低于對(duì)照。LC20、LC50濃度的α-蒎烯最大抑制率分別出現(xiàn)在36和48 h，最大抑制率分別為對(duì)照的40．74%和14．75%。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，用LC20濃度的α-蒎烯處理后的幼蟲(chóng)體內(nèi)POD酶活性表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，而LC50濃度的α-蒎烯處理后幼蟲(chóng)體內(nèi)POD酶活性表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。

2．5 α-蒎烯對(duì)黃粉蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的影響 由圖3可知，黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)經(jīng) LC20、LC50濃度的 α-蒎烯處理 12、24、36、48 h后，體內(nèi)CAT酶活性均顯著低于對(duì)照。LC20、LC50濃度的α-蒎烯最大抑制率分別出現(xiàn)在36和48 h，其最大抑制率分別為對(duì)照的34．62%和35．64%。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)表明，α-蒎烯的LC20、LC50濃度對(duì)黃粉蟲(chóng)體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)12、24、36、48 h的影響雖然存在差異性，但均表現(xiàn)出具有抑制功能。綜合時(shí)間－劑量效應(yīng)及酶受到抑制的程度，3種酶對(duì)α-蒎烯脅迫的敏感性從大到小依次為SOD、POD、CAT。關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

α-蒎烯能夠影響黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)SOD、POD和CAT的活性，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加呈現(xiàn)出一定的時(shí)間－濃度效應(yīng)，幼蟲(chóng)體內(nèi)的SOD、POD和CAT均表現(xiàn)為抑制作用，導(dǎo)致幼蟲(chóng)體內(nèi)平衡受到破壞，自身生理機(jī)能下降，最終導(dǎo)致幼蟲(chóng)的死亡。該3種保護(hù)酶均參與了黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)α-蒎烯的應(yīng)答機(jī)制，而關(guān)于α-蒎烯與該3種酶系基因水平的

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