鄭 佳， 丁 丹，2， 梁彥麗，2， 張亞東， 王才林

(1.江蘇省農業(yè)科學院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質水稻工程技術研究中心/國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京210014;2.南京農業(yè)大學農學院，江蘇 南京 210095)

水稻是中國人賴以生存的重要糧食作物，提高水稻產量一直以來都是科研人員研究的重點之一，矮化育種和雜交育種這兩大歷史性的科學研究成果使水稻產量在上世紀得到了較大幅度的提高［1-3］。隨著分子生物學日新月異的發(fā)展，研究者們開始從分子生物學這一角度思考如何提高水稻產量。水稻的產量主要取決于每株水稻的穗數(shù)，每穗的谷粒數(shù)以及粒質量，而粒質量主要由粒型決定［4］。

目前利用分子生物學手段定位和克隆到一些與粒型密切相關的基因如 GW2［5］、qSW5［6］/GW5［7-8］、GS3［9-10］、GS5［11］、GW8［12］和 qGL3［13］/GL3.1［14］等。GS5 是控制水稻粒寬、粒質量和充實度的主效QTL。Li等利用 zhenshan97和H94的雜交種構建的單倍體加倍性群體發(fā)現(xiàn)位于第5條染色體短臂上的GS5基因。通過形態(tài)學比較不同等位基因構成的近等基因系的水稻發(fā)現(xiàn)擁有大粒單倍型GS5基因的水稻幼穗的內稃，外稃在橫切面上擁有更多的細胞數(shù)目。與野生型相比，過表達大粒型GS5基因的植株在細胞周期G1/S階段的一些相關基因表達量上調。這些證據(jù)證明GS5作為細胞周期基因的上游正調控因子，其高表達量可以通過調節(jié)有絲分裂行為來增加細胞數(shù)目，從而控制籽粒大小。通過分析GS5基因ORF區(qū)和啟動子區(qū)域的序列發(fā)現(xiàn)位于啟動子區(qū)域的序列多態(tài)性是對粒形產生影響的原因，而非其編碼區(qū)［11］。

本研究以江蘇省農業(yè)科學院糧食作物研究所雜交秈稻項目組選育獲得的1個新的特大粒粳稻材料TD70和小粒秈稻Kasalath為研究對象，對2個水稻品種的GS5基因的基因組序列和cDNA序列進行克隆和分析，并設計1對SSR分子標記，對2個親本及來源于這2個親本的240個重組自交系(RILs)群體的GS5基因型和表型進行檢測，為明確粒型控制基因GS5在2種極端粒型水稻中的序列差異和作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

來源于天鵝谷///9520//(72-496/御糯)的特大粒粳稻TD70和小粒秈稻Kasalath，其粒寬2年平均分別為4.42 cm和2.55 cm;TD70/Kasalath的240個重組自交系(RILs)。用游標卡尺(精確到0.01 mm)測量240個RILs及其親本的單個籽粒長度。每個品種或株系隨機取5個單株，每株隨機選取10粒飽滿籽粒測定，取平均值作為粒寬的表型值。

1.2 植物DNA、RNA提取及cDNA合成

水稻DNA提取以新鮮葉片為材料，總RNA提取以生長旺盛期的根、莖、幼穗的混合樣為材料，DNA、RNA提取試劑盒采用 OMEGA 公司的 Plant DNA Kit和 Plant RNA Kit，提取的RNA用DNa se I處理樣本，瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA質量后進行第一鏈c DNA的合成。第一鏈cDNA合成試劑盒采用Fermentas公司RevertAid First Strand cDNA synthesis kit，膠回收采用 Axygen公司的膠回收試劑盒。

1.3 引物設計、合成與序列測定

特異性引物利用Primer Premier 5.0軟件設計，并由英濰捷基貿易有限公司合成，序列測定由英濰捷基貿易有限公司完成。

1.4 GS5基因的DNA序列的克隆

以提取的TD70和Kasalath基因組為模版，特異性基因GS5G1F、GS5G1R、GS5G2F和GS5G2R擴增引物通過聚合酶鏈式反應分段擴增GS5基因，測序結果利用DNAman進行拼接后即為完整的GS5基因DNA序列。以提取的 TD70和 Kasalath的總RNA為模版，反轉錄為cDNA后利用特異性擴增引物GS5F、GS5R通過聚合酶鏈式反應擴增GS5基因的cDNA全長。

1.5 PCR產物的克隆、純化與篩選

PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，確定片段大小正確無誤后，切膠回收，純化。連接到pGEM-T克隆載體上，熱激法導入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，進行氨芐抗性法和X-gal/IPTG藍白斑篩選，挑取陽性菌落在含有氨芐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進行菌液PCR，擴增程序為:94℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán);72℃5 min。電泳后將檢測為陽性的菌落送公司測序，約10個重復樣。

2 結果

2.1 GS5基因DNA、cDNA全長克隆與序列分析

已知的GS5基因(Os05g0158500)序列長4 466 bp，分段設計擴增引物 GS5G1F:5'-CTCCCATGGAATTACTAGAGAA-3'，GS5G1R:5'-TTGGACATGTTTACATCCACAT-3';GS5G2F: 5'-TGTATGGTCTAACATTCAGAATTC-3'，GS5G2R:5'-GCGCACTTGAAATTGATTTG-3'。利用 NCBI的 Primerblast檢測引物對在水稻中僅可以擴出1個片段。利用引物對在TD70和Kasalath的全基因組中擴增出的片段測序拼接后發(fā)現(xiàn)TD70品種中該片段TGS5g長度為 4 449 bp，Kasalath品種中該片段KGS5g長 度 為 4 441 bp，它 們 與 已 知 GS5(Os05g0158500)基因的序列相似性達99.82%。

利用已擴增出的基因組序列結合NCBI上下載的已知GS5基因序列信息，設計cDNA擴增引物GS5F: 5'-ATGGCGGTGGCGG-3'，GS5R: 5'-TCATCTGCTTGTCGGAAG-3'，在 TD70 和Kasalath反轉錄的cDNA模版上分別擴增出1條約1 500 bp大小的片段。測序結果顯示，TD70品種中該片段TGS5長度為1 449 bp，編碼482個氨基酸殘基，Kasalath品種中該片段KGS5長度為1 443 bp，編碼480個氨基酸殘基，它們與已知 GS5(Os05g0158500)序列相似性達99.84%。TGS5和Os05g0158500的開放閱讀框在堿基的+92位是G，因此第31位編碼的氨基酸為甘氨酸;KGS5的開放閱讀框在堿基的+92位是C，該位點編碼的氨基酸為丙氨酸，且在+106～111 bp缺失GGCGGC6個堿基，即第36、37位編碼的氨基酸缺失2個甘氨酸(圖1)。

比較GS5基因的DNA序列和cDNA序列發(fā)現(xiàn)TGS5和KGS5基因在基因結構上包含10個外顯子和9個內含子(圖2)。

2.2 GS5基因分子標記設計及驗證

分析TD70和Kasalath的GS5基因序列上的多處差異，根據(jù)KGS5基因第一外顯子中GCGGCG的缺失設計SSR(Simple sequence repeats)標記，正向引物GS5SSR-F:5'-AGGCGGCGAGATGTCTCTTGTC-3'，反 向 引 物 GS5SSR-R:5'-CTGCGCCTCGAAGAACCAGTAG-3'(圖3)。該引物在 TD70中可以擴增出216 bp的條帶，在Kasalath中可以擴增出210 bp的條帶(圖4)。

2.3 功能標記對TD70/Kasalath RIL群體的鑒定

利用上述分子標記檢測TD70與Kasalath為親本構建的重組自交系群體的結果顯示，240個株系中含有GS5-T基因(表現(xiàn)TGS5基因型)的株系有122個，含有GS5-K(表現(xiàn)KGS5基因型)基因的株系有118個。含GS5-T基因的株系平均粒寬為 (3.26±0.37)mm，平均千粒質量為 (32.61±7.66)g，含GS5-K基因的株系平均粒寬為 (2.98±0.28)mm，平均千粒質量為 (29.74±6.36)g，兩者分別相差0.47 mm和2.87 g，粒寬存在極顯著差異(表1)，說明GS5是水稻粒寬性狀的主效調控基因。此外，GS5對水稻的粒長、粒厚都有一定的影響，具有多效調節(jié)作用。

2.4 GS5基因對水稻粒寬的作用及與已知其他基因的比較

GW2基因是控制水稻粒寬的主效基因，某些大粒型水稻品種中存在的功能缺失型是籽粒變寬的重要調節(jié)因素，我們之前的研究已經證實本試驗所用研究材料TD70品種擁有稀有的GW2功能缺失型，是TD70的超寬籽粒的正向調控因子［15］，且在TD70和 Kasalath構建的重組自交系中，GW2對粒寬的貢獻較大，含GW2－T基因的株系平均粒寬比含GW2－K基因的株系平均粒寬分別高出0.47～0.51 mm，千粒質量高出5.54～6.05 g［15］。本試驗發(fā)現(xiàn)同一重組自交系群體中，含GS5－T基因的株系平均粒寬比含GS5－K基因的株系平均粒寬高出0.47 mm，千粒質量高出2.87 g。說明GS5對粒寬調控效應與GW2相當，但是對千粒質量的調控效應沒有GW2強。

圖1 TD70品種中GS5基因片段及預測編碼的氨基酸Fig.1 GS5 sequence fragment and encoded protein prediction in TD70

圖2 TGS5和KGS5的基因結構Fig.2 Structure of TGS5 and KGS5 genes

圖3 TGS5和KGS5差異位點及引物序列所處的位置Fig.3 The polymorphic loci and primers locations of TGS5 and KGS5

圖4 GS5分子標記對TD70、Kasalath和RIL群體中的擴增結果Fig.4 PCR amplification of GS5 with SSR marker in TD70，Kasalath and RILs

表1 含不同來源的GS5基因的株系的粒型表現(xiàn)Table 1 Grain phenotype of lines with different GS5 genotypes

3 討論

GS5是控制水稻粒寬、粒質量和充實度的主效QTL。已有研究結果表明GS5基因啟動子區(qū)域的序列多態(tài)性是影響水稻粒寬的原因，而非其編碼區(qū)［11］。本試驗通過對極端粒型水稻TD70和Kasalath 2個品種的GS5基因的研究并未發(fā)現(xiàn)文獻報道的啟動子區(qū)域的差異，但是編碼區(qū)存在GGCGGC的插入缺失位點。寬粒TD70型的GS5基因較窄粒Kasalath型GS5基因所編碼的氨基酸序列中存在1個甘氨酸向丙氨酸的變化和2個丙氨酸的增加。本研究利用該差異位點成功設計區(qū)分2種類型GS5基因的SSR標記，對重組自交系群體分型后發(fā)現(xiàn)TD70型的GS5基因對水稻粒寬具有顯著的正調控作用，效應與GW2相當，對粒寬、粒厚和千粒質量也有一定的正向調控效應。在高粱、玉米等其他禾本科植物中也發(fā)現(xiàn)了水稻GS5基因的直系同源基因，有些物種內還存在側向同源基因 ，說明GS5基因對籽粒的調控作用并不單一存在于水稻中。

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