劉桂榮，康亞輝，馬建新，李雪梅

(江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院腫瘤放療科 222000)

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·論 著·

熱療和熱療聯(lián)合放療對人食管癌ECA109細(xì)胞凋亡的影響

劉桂榮，康亞輝，馬建新，李雪梅△

(江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院腫瘤放療科 222000)

目的 研究熱療和熱療聯(lián)合放療對人食管癌ECA109細(xì)胞凋亡的影響。方法 將人食管癌ECA109細(xì)胞分為4組：正常對照組、單純熱療組、單純放療組和熱療+放療組，在熱療聯(lián)合不同照射劑量下誘導(dǎo)ECA109細(xì)胞凋亡，以流式Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測其凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)，克隆集落形成實(shí)驗(yàn)觀察熱療的輻射增敏作用。結(jié)果 通過多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線，可見熱療+放療組的ECA109細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于單純放療組(P<0.01)，熱療聯(lián)合放療可以增加細(xì)胞的輻射敏感性，輻射增敏比為1.24；與單純放療組相比，熱療+放療組ECA109細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；相對于單純放療和單純熱療，熱療+放療作用于人食管癌ECA109細(xì)胞可以使凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax的表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低。結(jié)論 熱療能夠提高人食管癌細(xì)胞的放射敏感性，其機(jī)制可能與熱療增加人食管癌細(xì)胞的凋亡率密切相關(guān)。

熱療； 放療； 食管癌； 放射敏感性

我國是食管癌高發(fā)國家，在我國因惡性腫瘤死亡的病例中，食管癌高居第4位[1]。手術(shù)雖是治療食管癌的首選方法，但手術(shù)的創(chuàng)傷性大，患者術(shù)后生活質(zhì)量較差，并且部分患者因發(fā)現(xiàn)較晚而失去手術(shù)機(jī)會。熱療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療和生物治療之后的第5類治療手段[2]，熱療聯(lián)合放療在腫瘤的臨床治療中應(yīng)用較多，并且臨床療效明顯。包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生是由細(xì)胞增殖和凋亡的不平衡造成的[3]，研究表明熱療主要通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮治療腫瘤的作用，caspase-3則是細(xì)胞凋亡信號通路中的重要調(diào)節(jié)分子之一[4]。此外，凋亡的發(fā)生受多種基因調(diào)控，其中Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中的作用備受關(guān)注。Bcl-2為凋亡抑制蛋白，Bax為凋亡促進(jìn)蛋白,兩者形成異二聚體抑制Bcl-2的功能，均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[5]。盡管熱療增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射敏感性及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用已經(jīng)受到越來越多的重視，但熱療聯(lián)合放療對人食管癌ECA109細(xì)胞的影響的報(bào)道甚少。本研究初步探討熱療聯(lián)合放療對人食管癌ECA109細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，為熱療與放療聯(lián)合治療食管癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 人食管癌ECA109細(xì)胞株均為本科室保存標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 含10%新生牛血清、胰蛋白酶及完全型RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；羊抗兔二抗、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液、放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、TE電泳緩沖液、10×Western轉(zhuǎn)膜緩沖液、30%Acry-Bis、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)均購自海門碧云天生物技術(shù)研究所；Bcl-2兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；caspase-3兔抗人單克隆抗體購自谷歌生物；Bax兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司；GAPDH兔抗人單克隆抗體購自美國Bioworld公司，Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞檢測試劑盒及吉姆薩染液均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。23EX醫(yī)用直線加速器(美國VARIAN公司)，F(xiàn)ACS Aria流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，Mini-PROTEAN4電泳儀(美國Bio-rad公司)，ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 照射及加熱 采用6 MV的X射線垂直照射，源靶距(SSD)100 cm，照射野面積15 cm×20 cm，吸收劑量率為400 cGy/min。恒溫孵育箱，溫度為(43±0.1)℃。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人食管癌ECA109細(xì)胞株用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。對照組：在37 ℃孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)；單純放療組：以0、1、2、4、6、8 Gy照射，不同劑量照射后繼續(xù)在37 ℃孵育箱中培養(yǎng)；單純熱療組：使用恒溫孵育箱(43±0.1)℃，加熱處理60 min后，再置于37 ℃恒溫箱中；熱療+放療組：照射前于恒溫孵育箱(43±0.1)℃加熱，再按不同照射劑量(0、1、2、4、6、8 Gy)照射后置于37 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞分組處理之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其中單純放療組和熱療+放療組均予以6 Gy照射。收集細(xì)胞后用4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍后消化離心，重懸計(jì)數(shù)使其密度大于1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙錠溶液(PI)混勻后，于室溫避光孵育15 min。于流式細(xì)胞儀上檢測，激發(fā)波長(Ex)488 nm，發(fā)射波長(Em)530 nm，計(jì)算凋亡率。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-3、Bax及Bcl-2表達(dá) 細(xì)胞分組處理之后于37 ℃孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其中單純放療組和熱療+放療組均予以6 Gy照射。收集各組細(xì)胞，用1×SDS-PAGE上樣緩沖液裂解不同處理組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度，制作10%分離膠和5%濃縮膠，待其凝固后加入蛋白樣品15 μL。電泳條件：80 V，10 min；120 V，30 min。轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，轉(zhuǎn)膜條件：恒流300 mA，90 min。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜浸潤在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中1 h，加入特異性一抗(1∶400)于4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，最后加入發(fā)光底物經(jīng)X射線曝光顯示蛋白條帶。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次。

1.3.5 克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測熱療的輻射增敏作用 取指數(shù)生長期的人食管癌ECA109細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種于六孔板中，細(xì)胞分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次，當(dāng)六孔板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)(約10 d)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS沖洗3遍，無水甲醇固定10 min，姬姆薩染色15 min，然后用流動(dòng)水洗去染色液，自然晾干后于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?%)=(對照組克隆數(shù)/實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù))×100%，存活分?jǐn)?shù)(SF)=實(shí)驗(yàn)組克隆形成率/對照組克隆形成率。根據(jù)多靶單擊模型SF=1-(1-e-D/D0)N擬合細(xì)胞存活曲線，式中D為放射劑量；D0為曲線指數(shù)下降63%所需的劑量，即平均致死劑量；D0=1/k，k為存活曲線斜率；N為外推數(shù)，Dq為細(xì)胞受損所需的準(zhǔn)閾劑量，Dq= D0×lnN。計(jì)算輻射增敏比(SER)，SER=D0(對照組)/D0(實(shí)驗(yàn)組)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié) 果

2.1 熱療對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，單純放療與單純熱療組人食管癌ECA109細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax的表達(dá)均上調(diào)，說明單純放療、熱療均具有促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；而熱療+放療組促凋亡蛋白表達(dá)更加明顯，說明熱療聯(lián)合放療可以明顯地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。然而，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)則截然相反，再次驗(yàn)證了熱療對放療的增敏效應(yīng)。見圖1。

圖1 Western blot檢測各組ECA109細(xì)胞中

2.2 熱療對人食管癌ECA109細(xì)胞放射敏感性的影響 人食管癌ECA109細(xì)胞經(jīng)過處理后，根據(jù)單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算出熱療+放療組的SER?？梢姛岑?放療組的SF明顯低于單純放療組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.659 2，P<0.01)。見圖2。細(xì)胞加熱后再受到不同劑量X射線的照射，細(xì)胞存活曲線明顯改變，存活曲線的斜率增大，D0值下降，SER為1.24，說明熱療具有明顯的輻射增敏作用。見表1。

圖2 不同處理組ECA109細(xì)胞存活曲線圖

組別kND0DqSF2SER單純放療0.312.663.232.150.87-熱療+放療0.512.691.961.660.701.24

注：SF2為單次照射2 Gy的SF；-表示無數(shù)據(jù)。

2.3 不同處理組人食管癌ECA109細(xì)胞流式結(jié)果 熱療+放療組ECA109細(xì)胞凋亡率明顯高于單純熱療組(P<0.05)和單純放療組(P<0.05)，說明熱療與X射線聯(lián)合作用有增加食管癌細(xì)胞凋亡的作用，即熱療對食管癌細(xì)胞有輻射增敏作用。見圖3、表2。

圖3 不同處理組ECA109細(xì)胞流式結(jié)果

組別n細(xì)胞凋亡率(%)空白對照組314.9±0.8單純熱療組380.8±1.3ab單純放療組390.3±1.1ab熱療+放療組395.2±1.5a

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與熱療+放療組比較，bP<0.05。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜的生理和病理過程，它在細(xì)胞生長、發(fā)育過程中對細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有重要的生物學(xué)意義，為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境所必需的過程。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅是細(xì)胞增殖失控的結(jié)果，也可能是由細(xì)胞凋亡受限所致。

caspase-3屬于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的成員，細(xì)胞凋亡開始時(shí)，actived-caspase-3剪切聚ADP-核糖聚合酶(PARP酶)使之成為85×103和31×103的2段多肽，進(jìn)而使PARP酶中與DNA相結(jié)合的兩個(gè)鋅指模體結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，失去其正常功能，Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性增高進(jìn)而裂解核小體間的DNA，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。而Bcl-2及其家族成員在細(xì)胞凋亡中起著雙重調(diào)節(jié)作用，Bcl-2與Bax決定細(xì)胞接受凋亡信號后存活與否，對腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生有重要意義；研究表明，Bcl-2表達(dá)下調(diào)和Bax表達(dá)上調(diào)能抑制腫瘤的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。

熱療是近20年再度興盛起來的腫瘤治療方式，其對局部腫瘤的治療效果是其他手段無法比擬的。大量研究結(jié)果顯示，無論是體內(nèi)還是體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞，在42～43 ℃的高溫均可被殺死，而較長時(shí)間置于同樣條件下的正常細(xì)胞并沒有明顯損害[7]。此外，有研究報(bào)道，熱療聯(lián)合放療可使治療效果提高，兩者聯(lián)合既可以增強(qiáng)對腫瘤的殺傷作用，又可以降低射線劑量，從而實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效作用[8]。

目前臨床上常采用43 ℃作為熱療溫度，且有報(bào)道顯示43 ℃可明顯促進(jìn)人食管癌ECA109細(xì)胞的凋亡[9]，因此本研究選擇43 ℃作為實(shí)驗(yàn)條件。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱療聯(lián)合放療可以明顯提高caspase-3和Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)。這提示熱療聯(lián)合放療能夠促進(jìn)ECA109細(xì)胞凋亡，且克隆形成實(shí)驗(yàn)提示其具有射線劑量依賴性。由此可見，熱療促進(jìn)ECA109細(xì)胞的凋亡可能是其增敏機(jī)制之一。

綜上所述，熱療能夠提高人食管癌細(xì)胞的放射敏感性，這可能與熱療可以提高凋亡促進(jìn)蛋白caspase-3和Bax的表達(dá)，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，增加食管癌細(xì)胞的凋亡率密切相關(guān)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部．全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報(bào)告[M]．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2008：10．

[2]詹宏杰，梁寒．腫瘤熱療的研究[J]．國外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊，2005，32(1)：35-38．

[3]Waxman DJ，Schwartz PS．Harnessing apoptosis for improved anticancer gene therapy[J]．Cancer Res，2003，63(24)：8563-8572．

[4]Chang HY，Yang X．Proteases for cell suicide:functions and regulation of caspases[J]．Microbiol Mol Biol Rev，2000，64(4)：821-846．

[5]Cory S，Adams JM．Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch[J]．Cancer Cell 2005，8(1)：5-6．

[6]Inoue S，Salah-Eldin AE，Omoteyama K．Apoptosis and anticancer drug resistance[J]．Hum Cell，2001，14(3)：211-221．

[7]Kim CS，Hill RP，Kumaradas JC，et al．Effect of simultaneous pulsed hyperthermia and pulsed radiation treatment on survival of SiHa cells[J]．Int J Hyperthermia，1998，14(6)：573-581．

[8]劉本春，張?jiān)迹[瘤熱療研究進(jìn)展[J]．國外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊，2004，31(10)：758-760．

[9]王希方，秦思達(dá)，杜寧，等．熱療通過提高活性caspase-3的表達(dá)促進(jìn)食管癌EC109細(xì)胞凋亡[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20(11)：2236-2239．

Effect of themotherapy and themotherapy combined with radiotherapy on apoptosis of human esophageal cancer cell ECA109

LIUGui-rong，KANGYa-hui，MAJian-xin，LIXue-mei△

(DepartmentofRadiotherapy,LianyungangMunicipalSecondPeople′sHospital,Lianyungang,Jiangsu222000,China)

Objective To research the effect of themotherapy and themotherapy plus radiotherapy on apoptosis of human esophageal cancer cell ECA109.Methods Human esophageal cancer cells ECA109 were divided into four groups:normal control group,themotherapy group,radiotherapy group and themotherapy plus radiotherapy group.The apoptosis of human esophageal cancer cell ECA109 were induced by the themotherapy combined with different radiation doses.The flow cytometry Annexin V-FITC/PI double staining was adopted to detect the apoptosis rate,intracellular caspase-3,Bax,Bcl-2 expression were detected by Western blot and the radiosensitizing effect of themotherapy was observed by the clone colony formation assay.Results By adopting the clicking multiple target model for fitting the cellular survival curves,the survival fraction of human esophageal cancer cells ECA109 cells in the themotherapy plus radiotherapy group was significantly lower than that in the simple radiotherapy group(P<0.01),the themotherapy plus radiotherapy could increase the cellular radiation sensitivity,the sensitization enhancement ratio was 1.24;compared with the simple radiotherapy group,the apoptosis rate of ECA109 cells in the themotherapy plus radiotherapy group was significantly increased(P<0.05).Compared with the simple radiotherapy and simple themotherapy,the themotherapy plus radiotherapy acting on human esophageal cancer ECA109 cells could significantly increased the expression of apoptosis related proteins caspase-3 and Bax,and significantly decreased the Bcl-2 expression.Conclusion Themotherapy can increase the radiosensitivity of human esophageal cancer cells,its mechanism may be closely related with themotherapy increasing the apoptosis rate of human esophageal cancer cells.

thermotherapy； radiotherapy； esophageal cancer； radiosensitivity

劉桂榮，女，本科，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放射治療及腫瘤熱療研究?！?/p>

，E-mail：lygcjc2009@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.026

A

1672-9455(2015)05-0646-03

2014-11-20

2014-12-28)