潘小平，洪曉綠，蔡高濤

(廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.感染科 510800)

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·論 著·

實時定量PCR檢測乳腺癌患者內(nèi)皮素-1的表達(dá)及其臨床意義*

潘小平1，洪曉綠2，蔡高濤1

(廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.感染科 510800)

目的 檢測內(nèi)皮素-1(EDN-1)基因在乳腺癌患者外周血中的表達(dá)情況，并探討它在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 選取2013年1月1日至2014年5月20日在花都區(qū)人民醫(yī)院接受乳腺手術(shù)且經(jīng)病理學(xué)證實為乳腺癌的患者54例納入試驗組，另選取同期體檢健康女性60例納入對照組。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測所有研究對象外周血EDN-1的表達(dá)情況，并分析其與各臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 乳腺癌患者外周血EDN-1表達(dá)水平高于體檢健康女性，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其表達(dá)水平為健康女性人群的5.877倍；EDN-1的表達(dá)水平與患者的年齡和腫瘤的組織類型均無關(guān)(P>0.05)，與患者的腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 EDN-1基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，實時定量PCR可以敏感、特異地檢測乳腺癌患者外周血中EDN-1的表達(dá)，可以為乳腺癌的篩查與早期診斷提供幫助，宜在臨床工作中開展。

內(nèi)皮素-1基因； 乳腺癌； 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

內(nèi)皮素(EDN)是一種細(xì)胞因子，它包括EDN-1、EDN-2和EDN-3，其傳導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[1]。大量研究表明，EDN傳導(dǎo)系統(tǒng)的改變可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活率，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲力，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2]。本研究采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(實時定量PCR)檢測EDN-1在乳腺癌中的表達(dá)情況，研究其與乳腺癌的關(guān)系，為探索乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展提供新的證據(jù)，從而為乳腺癌的診斷和治療提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2013年1月1日至2014年5月20日在本院接受乳腺手術(shù)且經(jīng)病理學(xué)證實為乳腺癌的女性患者54例納入試驗組，患者年齡33～74歲，平均(50.1±10.4)歲，其中年齡不超過50歲者32例，>50歲者22例。參照2003年版世界衛(wèi)生組織(WHO)乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)，其中T1期40例、T2期11例、T3期1例、T4期2例；區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期36例，N1-3期18例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0期45例，M1期9例；組織類型中導(dǎo)管型36例，小葉型18例。另選取本院同期體檢健康女性60例納入對照組，年齡23～74歲，平均(40.9±12.3)歲。

1.2 儀器及試劑 C1000 Thermal cycler 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國Bio-RAD公司)，7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，AF100制冷機(jī)(意大利Scotsman公司)，UV-1750紫外分光光度儀(日本島津公司)，ABI 3900臺式高通量DNA合成儀(美國Invitrogen公司)。Trizol購自美國Invitrogen公司(批號9109)；焦碳酸二乙酯(DEPC)購自美國Sigma公司；脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)購自美國Promega公司(批號M610A)；SYBR Premix EX Taq ⅡKit(批號RR820A)和PrimeScriptTMRT reagent Kit(批號RR047A)均購自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 在美國國家生物信息中心(NCBI)核酸序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)上查找目的基因和內(nèi)參基因mRNA序列，采用Primer express 2.0軟件設(shè)計引物，利用ABI 3900臺式高通量DNA合成儀對引物序列進(jìn)行合成，引物序列見表1。

表1 試驗引物序列

1.3.2 外周血總RNA提取及cDNA合成 使用Trizol Reagant試劑盒提取所有研究對象的外周血總RNA，隨后采用RNase-free的DNase Ⅰ試劑盒提純總RNA。取1 μL RNA樣品稀釋50倍，在紫外分光光度儀上測定吸光度(A)比值(A260/A280)，檢測RNA純度；取1 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳80 V，20 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s核糖體RNA(5s rRNA)，18s rRNA和28s rRNA條帶，鑒定RNA抽提質(zhì)量。取4 μL RNA，應(yīng)用隨機(jī)引物和PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，總體積20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，然后85 ℃ 5 s，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實時定量PCR 配制25 μL實時定量PCR反應(yīng)體系，其中cDNA 2 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPS)0.5 μL，Taq酶0.5 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，蒸餾水18.5 μL。反應(yīng)條件：93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 15 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。設(shè)定熔解曲線程序：93 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，從60 ℃緩慢升溫至93 ℃，每升高0.5 ℃檢測1次熒光信號值，反應(yīng)結(jié)束儀器自動生成循環(huán)閾值(Ct值)及熔解曲線圖。將cDNA以10倍倍比稀釋，以1、10-1、10-2、10-3、10-4cDNA作為模板，同時對EDN-1、β-actin進(jìn)行實時定量-PCR，檢測其擴(kuò)增效率是否一致。

2 結(jié) 果

2.1 RNA純度及抽提質(zhì)量 將提純的RNA在紫外分光光度儀上測定A260/A280比值均在1.8～2.0，證明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA條帶清晰可見，證明總RNA抽提比較完整。見圖1。

注：1～8號孔為不同樣本的總RNA。

圖1 總RNA的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA電泳圖

2.2 熔解曲線圖 EDN-1和β-actin各自的熔解曲線只有一條主峰，無其他雜峰干擾，熔解溫度均在82 ℃左右，證明實時定量PCR產(chǎn)物并非引物二聚體或其他雜帶，特異性較好。見圖2～3。

2.3 擴(kuò)增效率檢測 倍比稀釋的cDNA，經(jīng)實時定量PCR后，以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，擬合作圖，得到EDN-1與β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率分別為-3.395 231及-3.399 973，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 259及0.999 408，說明定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠；根據(jù)斜率分別計算出基因擴(kuò)增效率：EEDN-1=0.97，Eβ-actin=0.97(擴(kuò)增效率E = 10-1/斜率-1)，證明EDN-1與β-actin的擴(kuò)增效率相同，可采用2-△△Ct法分析本試驗結(jié)果。

圖2 EDN-1產(chǎn)物熔解曲線圖

2.4 實時定量PCR結(jié)果

2.4.1 兩組EDN-1的表達(dá)水平比較 乳腺癌患者EDN-1的表達(dá)水平較對照組明顯增加，其表達(dá)水平為對照組的5.877倍，組間EDN-1表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=8.246,P=0.000)。見表2。

2.4.2 乳腺癌患者EDN-1的表達(dá)與各臨床參數(shù)的關(guān)系 各年齡段及各腫瘤組織類型的患者EDN-1表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而不同腫瘤大小，不同區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，以及有、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者EDN-1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4.3 乳腺癌患者△Ct均值與各臨床參數(shù)的相關(guān)性分析 △Ct均值同樣與患者的年齡和腫瘤的組織類型無明顯相關(guān)性(P>0.05)；與是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(r=-0.290，P<0.05)，與腫瘤的大小和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著性相關(guān)(r=-0.622、-0.427，P<0.01)，見表3。

圖3 β-actin產(chǎn)物熔解曲線圖

組別n△Ct-△△Ct2-△△Ct試驗組54-3.114±1.4832.555±1.3245.877(2.347～14.713)對照組60-0.559±1.790

表3 乳腺癌患者EDN-1的表達(dá)水平與各臨床參數(shù)的關(guān)系±s)

3 討 論

EDN廣泛表達(dá)于腦、骨骼肌、胰腺、小腸、睪丸等組織中[4]。EDN經(jīng)前體蛋白翻譯后，裂解出一種含有21個氨基酸的生物活性物質(zhì)[5]，它們通過自分泌和旁分泌的方式與細(xì)胞表面的EDN-A和EDN-B受體 (EDNRA和EDNRB)相互作用[6]，參與細(xì)胞的生物功能，如細(xì)胞的增殖、分化及誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[7]。有研究證實，EDN與許多腫瘤有關(guān)，如卵巢癌、前列腺癌、成骨細(xì)胞瘤等[8-10]。然而，EDN能否導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生，以及它與乳腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程是否有關(guān)聯(lián)卻少見報道。

因此，本研究采用本實驗室建立的實時定量PCR反應(yīng)體系及條件，檢測了54例乳腺癌患者及60例體檢健康女性全血EDN-1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者全血EDN-1表達(dá)水平較對照組明顯增加，其表達(dá)水平為對照組的5.877倍，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明EDN-1與乳腺癌的發(fā)生有明顯的相關(guān)性，該結(jié)論與Wulfing 等[11]報道相同。進(jìn)一步在乳腺癌各臨床變量之間比較EDN-1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，EDN-1的表達(dá)水平與患者的年齡和腫瘤組織類型無關(guān)(P>0.05)，說明無論乳腺癌患者的年齡處在什么階段，EDN-1都會高度表達(dá)，并且在小葉型和導(dǎo)管型乳腺癌中EDN-1均會大量表達(dá)。但在不同腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，以及有、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者間比較中，EDN-1的表達(dá)存在差異，腫瘤越大，其表達(dá)水平越高；乳腺癌伴隨有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目越多，EDN-1的表達(dá)水平也越高；乳腺腫瘤若轉(zhuǎn)移至其他器官，EDN-1的表達(dá)水平也會增加，這說明EDN-1與乳腺癌的發(fā)展有明顯的相關(guān)性。而苗瑞政等[12]采用放射免疫分析法檢測EDN-1水平，不同腫瘤大小間比較并無差異，這與本研究結(jié)果有所不同，可能與采用不同的乳腺癌分類方法和不同的檢測方法有關(guān)。

本實驗只研究了EDN-1在乳腺癌患者中的表達(dá)情況，缺乏兩者之間因果關(guān)系的研究，即未能說明是乳腺癌的發(fā)生導(dǎo)致了EDN-1水平的增加，還是因為EDN-1的改變導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。同時也缺乏EDN的其他兩個成員(EDN-2與EDN-3)在乳腺癌中的表達(dá)情況的研究，缺乏三者之間的比較。但有研究表明，大鼠和狗體內(nèi)EDN-3能負(fù)性調(diào)節(jié)EDN-1的生物活性[13]，提示在人體組織或癌性組織中，EDN-1的高表達(dá)可能也受到EDN-3的調(diào)節(jié)，但有待進(jìn)一步的研究證實。另外，EDN-1在乳腺癌組織中的表達(dá)是否與外周血中的表達(dá)情況一致，也是本課題需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

綜上所述，乳腺癌患者EDN-1的表達(dá)水平較健康女性有明顯增加，與患者的年齡和腫瘤的組織類型無關(guān)，而與腫瘤的大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯的關(guān)聯(lián)性，證明EDN-1的增加與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。而實時定量PCR可以敏感、特異地檢測乳腺癌患者外周血中EDN-1的表達(dá)，能為乳腺癌的篩查與早期診斷提供幫助。臨床工作中，將EDN-1作為乳腺癌的輔助檢查之一，可以為臨床診治提供及時、準(zhǔn)確的參考，宜在臨床工作中開展。

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Determination of endothelin-1 expression in breast carcinoma by using real-time quantitative PCR and its clinical significance*

PANXiao-ping1，HONGXiao-lu2，CAIGao-tao1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofInfection,HuaduDistrictPeople′sHospital,Guangzhou,Guangdong510800,China)

Objective To detect the expression of endothelin-1(EDN-1) gene in peripheral blood of the patients with breast carcinoma,and to investigate its role in the occurrence and development of breast carcinoma.Methods A total of 54 patients with pathologically confirmed breast carcinoma receiving operation in our hospital from 1st Jan.2013 to 20th May 2014 were selected as the experimental group.Other 60 healthy women of physical examination were selected as the control group.The real-time quantitative PCR was adopted to detect the expression of EDN-1 gene in peripheral blood of all objects.The relationships between the EDN-1 gene expression and clinicopathological parameters were analyzed.Results The expression of peripheral blood EDN-1 gene in the patients with breast carcinoma was significantly higher than that in healthy women,the difference was statistically significant (P<0.01)，and the expression level of EDN-1 gene was 5.877 times higher than that of healthy women.The expression level of EDN-1 had no correlation with the age of patients and the pathological types of breast carcinoma(P>0.05),while had close correlation with the tumor size,regional lymph node metastasis and distant metastasis(P<0.05).Conclusion EDN-1 gene might closely correlated with the occurrence and development of breast carcinoma.The real-time quantitative PCR could sensitively and specifically detect the peripheral blood expression of EDN-1 gene in breast carcinoma,which might be helpful for the screening and early diagnosis of breast carcinoma and could be carried out in clinical practice.

endothelin-1 gene； breast carcinoma； real-time quantitative PCR

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20131A011187)。

潘小平，男，碩士，主管檢驗技師，主要從事臨床生化與分子診斷學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.005

A

1672-9455(2015)05-0587-04

2014-10-16

2014-12-10)