牛泓博，聶鴻濤，朱德鵬，楊 鳳，閆喜武

大連海洋大學，遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心, 大連 116023

菲律賓蛤仔EST_SSR標記與生長性狀的相關分析

牛泓博，聶鴻濤，朱德鵬，楊 鳳，閆喜武*

大連海洋大學，遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心, 大連 116023

研究利用20 個微衛(wèi)星標記對菲律賓蛤仔斑馬蛤F2代家系107 個個體進行遺傳多樣性分析，并對標記位點與生長相關性狀進行分析。在20 個微衛(wèi)星位點共檢測到41 個等位基因，各位點等位基因數為2—3 個，等位基因片段大小為109—430 bp，平均等位基因數為2.05 個。平均有效等位基因數為1.71個，觀測雜合度平均值為0.504，期望雜合度的平均值為0.431，平均多態(tài)信息含量為0.324。經卡方檢驗，3 個位點SSR11，SSR164和SSR213的基因型分布顯著偏離了孟德爾定律(P<0.01)。運用SPSS 20.0對20 個微衛(wèi)星位點與菲律賓蛤仔斑馬蛤家系生長性狀的相關性(殼長、殼寬、殼高和體重)進行連鎖顯著性檢驗。結果表明，SSR9位點與殼高存在顯著的相關關系(P<0.05)，SSR135和SSR164位點與殼寬呈顯著相關(P<0.05)，SSR142位點與體重呈顯著性相關(P<0.05)。研究結果可為菲律賓蛤仔的分子標記輔助選育提供參考。

菲律賓蛤仔; 微衛(wèi)星標記; 生長性狀; 相關分析

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)隸屬于軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，簾蛤科(Veneridae)，蛤仔屬(Ruditapes)，是我國傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖貝類之一，廣泛分布在我國南北沿海。據統(tǒng)計，2010年菲律賓蛤仔世界產量達到360多萬t[1]，我國年產量在300 萬t左右，占世界菲律賓蛤仔產量的90%以上[2]。由于其營養(yǎng)豐富、味道鮮美，近年來市場需求量也日益增大。然而由于人工苗種的累代養(yǎng)殖，菲律賓蛤仔養(yǎng)殖群體的種質逐漸下降，養(yǎng)殖產業(yè)迫切需要菲律賓蛤仔的優(yōu)良品種。近年來，菲律賓蛤仔的遺傳改良技術取得了一定的成績，如選擇育種和雜交育種等[2-6]。傳統(tǒng)育種方法對目標性狀缺乏準確可靠的早期預選手段，造成育種盲目性大、效率低。而緊密連鎖的DNA標記為實現水產動物目標性狀的早期選擇提供了有效途徑。因此，研究與水產動物重要經濟性狀緊密連鎖的分子標記，特別是對缺乏遺傳連鎖圖譜的水產動物DNA標記，就顯得十分重要。

微衛(wèi)星(microsatellites)又稱簡單序列重復(Simple Sequence Repeat, SSR)，一般由1—6 bp的簡單序列重復排列組成。由于微衛(wèi)星具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、遵循孟德爾分離定律、易于(Polymerase Chain Reaction) PCR擴增等優(yōu)點，是分子遺傳學研究的理想分子標記，已廣泛應用于水產動物的重要經濟性狀相關分子標記篩選、(Quantitative Trait Locus) QTL定位等方面[7-15]。在海洋貝類，蝦夷扇貝[16]和馬氏珠母貝[17]等已報道了生長性狀與微衛(wèi)星標記的相關性分析。目前，對菲律賓蛤仔的研究，主要集中在生物學、生態(tài)學和養(yǎng)殖技術等方面[2]。然而，有關菲律賓蛤仔重要經濟性狀的分子基礎研究還剛剛起步，標記與生長性狀的相關分析迄今還未見報道。

本實驗利用20 對微衛(wèi)星標記對菲律賓蛤仔斑馬蛤家系進行遺傳多樣性分析，并對標記位點與生長性狀相關性進行分析，篩選出對斑馬蛤生長有利的基因型，實現分子標記和生長性狀的連鎖分析。為菲律賓蛤仔優(yōu)良品系的進一步選育，以及遺傳圖譜的構建和QTL定位等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用斑馬蛤材料為2011年大連石河菲律賓蛤仔野生群體中挑選的斑馬蛤為親本，交配產生F1代群體，上選F1代群體中大的個體，采用巢式設計建立了30 個F1家系，本實驗所用家系為第8 組家系，隨機選取其中107 個個體，對所有個體的殼長、殼寬、殼高和體重進行測量。取部分足尖組織，固定于95%乙醇中用于DNA的提取。

1.2 DNA提取及微衛(wèi)星分析

DNA的提取采用苯酚-氯仿-異戊醇法抽提DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?。PCR反應體系：反應總體積為10 μL，其中DNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L) 各0.4 μL、easytaq MIX 5 μL、ddH2O 3.2 μL。實驗中所用微衛(wèi)星引物的核心序列及退火溫度見表1。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，退火溫度40 s，72 ℃ 40 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。凝膠在掃描儀上成像，拍照保存后對電泳譜帶進行分析。等位基因大小用100 bp marker為參照標準對電泳條帶進行判讀。

表1 菲律賓蛤仔20個微衛(wèi)星引物序列和退火溫度Table 1 Characteristics of the 20 polymorphic microsatellite loci from Ruditapes philippinarum

1.3 統(tǒng)計分析

用PopGene3.2軟件進行數據處理、遺傳多樣性分析, 計算等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)及期望雜合度(He)。根據Botstein等[18]的方法可計算多態(tài)信息含量(PIC)。利用PIC-CALC計算軟件，根據等位基因頻率來計算每個位點的多態(tài)信息含量，其計算公式如下：

式中，n為某一位點上的等位基因數；pi、pj分別為群體中第i和第j個位點的等位基因頻率，j=i+1。

用SPSS20.0軟件中的一般線性模型(GLM) 對菲律賓蛤仔斑馬蛤家系的生長相關性狀與20個微衛(wèi)星標記相關性進行分析。其線性模型如下：

yij=μ+gi+εij

式中,yij為斑馬蛤某性狀第i個標記第j個個體表型值,μ為群體平均值，gi為第i個標記的效應值，εij為隨機誤差。

2 結果

2.1 性狀的表型值分布

經測量得到的殼長、殼寬、殼高和體重4 個生長性狀，均符合正態(tài)分布，可直接進行相關性分析。正態(tài)分布信息見表2。

表2 殼長、殼寬、殼高和體重的表型數據及正態(tài)分布統(tǒng)計檢驗Table 2 The phenotypic data of shell lenth, width, height, body weight and normal distribution test

2.2 微衛(wèi)星位點基因型

圖1 引物SSR372和SSR373在斑馬蛤F2 家系部分個體的聚丙烯電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR product of partial individuals in the F2 family of Ruditapes philippinarum amplified with microsatellite marker SSR372 and SSR373

利用父母本和8個子代進行引物篩選，經PCR 擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳，從32 對微衛(wèi)星引物中篩選得到20 對擴增條帶清晰、穩(wěn)定，具有多態(tài)性的位點。檢測了父母本和107 個F2子代個體在20 個微衛(wèi)星位點的基因型(表3)。SSR372和SSR373位點在菲律賓蛤仔斑馬蛤家系部分個體中的擴增結果見圖1。

20 個微衛(wèi)星位點共檢測到41 個等位基因，片段大小為109—430 bp，各位點的等位基因數2—3 個，平均等位基因數2.05 個，平均有效等位基因數為1.71 個。各位點的期望雜合度、觀測雜合度、基因型分布和多態(tài)信息含量等值見表3。20 個位點的期望雜合度平均值為0.431，觀測雜合度平均值為0.504，多態(tài)信息含量平均值為0.324。在20 個位點中，有2 個位點SSR213和SSR261的觀測雜合度低于期望雜合度，表現出純合子過剩、雜合子不足現象。另外18 個位點的觀測雜合度則高于期望雜合度，其中SSR11和SSR164的觀測雜合度與期望雜合度的差異較大。經卡方檢驗，有17 個位點的基因型比例符合孟德爾分離定律，另外3 個位點SSR11，SSR164和SSR213的基因型分布顯著偏離了孟德爾定律(P<0.01)(表3)。

表3 菲律賓蛤仔20個微衛(wèi)星位點在斑馬蛤F2家系中的統(tǒng)計信息Table 3 Statistic information for 20 microsatellite loci in an F2 family of Ruditapes philippinarum

Na: The number of alleles;Ne: Number of effective alleles;Ho: Observed heterozygosity;He: Expected heterozygosity; PIC: Polymorphism information content;P為基因型分離比的卡方檢驗；加粗P值代表偏分離的基因型分離比 (P<0.01)

2.3 微衛(wèi)星標記與生長性狀的相關性分析

用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型(General Linear Model, GLM)，對微衛(wèi)星位點基因型與斑馬蛤主要生長性狀(殼長、殼寬、殼高和體重)之間的相關性進行分析，經方差分析檢驗呈顯著性差異的位點。在20 對微衛(wèi)星位點中，共找出4 個與斑馬蛤生長相關的位點(表4)。SSR9位點與殼高呈顯著關聯，SSR135和SSR164與殼寬顯著相關，SSR142位點與體重呈顯著性相關。由于相關分析得到的微衛(wèi)星位點除SSR9號引物外其他3 個位點基因型個數都小于3，故使用SPSS中compare means過程進行不同位點表型值的比較。在SSR9位點上，AA基因型的殼長，殼寬，殼高和體重4 項生長指標平均值均高于其他基因型個體，說明AA基因型對斑馬蛤生長起正效應。另外，SSR135位點上的BB基因型、SSR142位點上的AA基因型和SSR164位點上的AB基因型，在4 項生長指標中的平均值均高于各自位點中的其他基因型，說明4個基因型在各自位點上對斑馬蛤的生長具有正效應。

表4 20個微衛(wèi)星位點不同基因型主要生長性狀的平均值及多重比較Table 4 Means and multiple comparisons of major growth traits with different genotypes at 20 microsatellites

上標字母表示在同一位點中不同基因型之間差異顯著(P<0.05)，無字母表示基因型間差異不顯著，*表示與生長相關的位點

3 討論

群體的遺傳多樣性主要表現在雜合度、等位基因數和多態(tài)信息含量三個方面。雜合度大小可以反映出遺傳結構變異程度的高低，雜合度期望越高，群體的遺傳結構越復雜[19]。本實驗中，觀測雜合度和期望雜合度的平均值分別為0.504和0.431，說明實驗家系的遺傳變異和遺傳多樣性較豐富。從等位基因來看，有效等位基因越接近所檢測到的等位基因的絕對值，說明等位基因在群體中的分布越均勻[20]。本研究在20 個微衛(wèi)星位點共檢測到41 個等位基因，其中有效等位基因數為34 個，接近于實際等位基因數，表明所檢測的微衛(wèi)星位點的等位基因在群體中分布較均勻。多態(tài)信息含量可作為一個衡量遺傳標記所包含的或能提供的遺傳信息容量的指標。一般認為，在某一群體中，當PIC> 0.5時該位點表現為高度多態(tài)，0.25

在許多海洋貝類中，經常會出現偏分離的等位基因，這似乎是海洋貝類中普遍存在的現象。在本實驗中，發(fā)現3 個微衛(wèi)星位點的基因型分離比顯著偏離孟德爾遺傳定律(P<0.01)，部分位點偏分離的原因可能與生活環(huán)境和人工選擇有關，再有可能是由隱性致死基因、取樣或基因型判讀錯誤等因素引起[22]。大部分微衛(wèi)星位點的期望雜合度與觀測雜合度基本接近，說明群體內的基因型頻率未發(fā)生大的改變。但有2 個位點SSR11和SSR164的觀測雜合度明顯大于期望雜合度，在SSR164發(fā)現了一種純合子完全缺失的現象(基因型AA為0)，說明該位點附近可能存在著與之緊密連鎖的隱性致死基因[23]。

菲律賓蛤仔的殼長、殼寬、殼高、體重等性狀屬于數量性狀，數量性狀受多個基因的控制，其遺傳基礎比較復雜且容易受環(huán)境的影響。標記與性狀之間的連鎖分析，是根據標記位點的基因型以及數量性狀的表型對個體進行顯著性檢驗，差異顯著則說明標記與數量性狀存在關聯[24]。因此，如果一個群體的性狀差異顯著，或兩個群體的差異很大，就可以通過標記與性狀的相關分析，找出性狀與一個或多個標記的遺傳相關，一旦發(fā)現顯著相關，即可認為存在一個數量性狀位點，從而實現從表型到基因型選擇育種的轉變[25]。借助微衛(wèi)星標記進行性狀連鎖分析或 QTL 定位，在水產動物育種中已也有較多報道[10-17]。

目前，菲律賓蛤仔遺傳標記的開發(fā)較少, 不足以滿足遺傳作圖和QTL 定位的需要。所以，有必要應用有限的微衛(wèi)星標記對菲律賓蛤仔生長相關性狀進行連鎖分析。在本研究中，共找到了4 個與生長性狀相關的位點，SSR9位點與殼高存在顯著的相關關系(P<0.05)，SSR135和SSR164與殼寬顯著相關(P<0.05)，SSR142與體重顯著相關(P<0.05)。在這些關聯中，出現了幾個標記同一個性狀相關，說明這些位點存在多因一效的現象，并符合數量性狀的相關理論。對上述位點不同基因型的多重比較表明，SSR9位點的AA基因型、SSR135位點的BB基因型、SSR142位點的AA基因型和SSR164位點的AB基因型都與殼長、殼寬、殼高和體重性狀呈正相關。目前，分子標記在菲律賓蛤仔中的應用主要集中于遺傳多樣性研究[26-27]，有關菲律賓蛤仔性狀相關分子標記的篩選迄今未見報道。本文篩選出菲律賓蛤仔生長性狀相關的微衛(wèi)星標記，為菲律賓蛤仔分子標記輔助選育提供參考。

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Identification of EST_SSR markers associated with growth-related traits in the Manila clamRuditapesphilippinarum

NIU Hongbo, NIE Hongtao, ZHU Depeng, YANG Feng, YAN Xiwu*

EngineeringandTechnologyResearchCenterofShellfishBreedingofLiaoningProvince,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China

The Manila clam,Ruditapesphilippinarum, which is widely distributed along the coasts of China, is an economically important marine bivalve species in China′s aquaculture industry. The world production of this species was 3.6 million metric tons in 2010. China is the first largest country in the world in terms of production of the Manila clam, producing about 3.0 million metric tons annually, which accounts for about 90% of global production. This species has several pedigrees including White, Zebra, Liangdao Red and Marine Red distributing in the coastal areas in North China. Microsatellites or simple sequence repeats (SSRs) are tandemly repeated motifs of 1—6 genetic base pairs. Microsatellite markers are powerful molecular markers due to their high polymorphism, stability, and co-dominance, and they are used widely in studies of genetic diversity, parentage assignment, genetic linkage map construction, and trait-related marker screening. In this study, 20 microsatellite DNA markers were used to analyze the genetic diversity of 107 individuals of a Zebra F2 pedigree ofR.philippinarum. Forty-one alleles were detected, and the number of alleles (Na) was 2—3 at each locus (average, 2.05). The effective number of alleles (Ne) was 1.71, and the DNA fragment length was 109—430 base pairs. The mean values of observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He), and polymorphism information content (PIC) were 0.504, 0.431, and 0.324, respectively. The probability value of the chi-square test showed that three loci significantly deviated from Mendelian segregation (P<0.01), which suggested that these loci might link with the adaptive gene, and two loci (SSR11 and SSR164) may link with recessive homozygous lethal genes. The general linear model procedure in SPSS20.0 was used to analyze the correlation between the 20 microsatellites and growth-related traits ofR.philippinarum(i.e., shell length, shell width, shell height, and body weight). Four loci were significantly related to the growth traits (P<0.05): SSR135 and SSR164 were significantly related to shell width (P<0.05), SSR9 was significantly related to shell height (P<0.05), and SSR142 was significantly related to total weight (P<0.05). Favorable genotypes for each growth trait were identified by a multiple comparison among the loci. Allele A for SSR9 had a significant impact on shell height (P<0.05) and had the highest phenotype value; thus, it can be used as a molecular marker for selective breeding. SSR135 and SSR164 had a significant impact on shell width and total weight (P<0.05), respectively, and allele B for SSR135 and allele A for SSR142 had a positive effect on growth-related traits. The following four genotypes of these loci had a favorable effect on growth-related traits: AA for SSR9, BB for SSR135, AA for SSR142, and AB for SSR164. The trait-related microsatellite loci identified in this study will be valuable for marker-assisted breeding ofR.philippinarum.

Ruditapesphilippinarum; microsatellites; growth-related traits; correlation analysis

國家自然科學基金(31302183); 國家高技術研究發(fā)展計劃“863”項目(2012AA10A400); 現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-48)

2013-05-16;

日期:2014-04-25

10.5846/stxb201305161083

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yanxiwu@dlou.edu

牛泓博，聶鴻濤，朱德鵬，楊鳳，閆喜武.菲律賓蛤仔EST_SSR標記與生長性狀的相關分析.生態(tài)學報,2015,35(6):1910-1916.

Niu H B, Nie H T, Zhu D P, Yang F, Yan X W.Identification of EST_SSR markers associated with growth-related traits in the Manila clamRuditapesphilippinarum.Acta Ecologica Sinica,2015,35(6):1910-1916.