夏曉君，董愛(ài)梅，張建強(qiáng)

（1.解放軍第107醫(yī)院，山東煙臺(tái)264002；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南250101；3.山東省皮膚和黏膜給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250101）

0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌效力研究

夏曉君1，董愛(ài)梅2，張建強(qiáng)3

（1.解放軍第107醫(yī)院，山東煙臺(tái)264002；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南250101；3.山東省皮膚和黏膜給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250101）

目的探索0.1%玻璃酸鈉滴眼液中抑菌劑的合理添加劑量。方法根據(jù)藥物成分的特性，選擇適宜的抑菌劑，并對(duì)不同配比濃度抑菌劑的抑菌效果進(jìn)行初步考察，篩選出適宜的供試品抑菌劑加入量。將《中國(guó)藥典》規(guī)定的微生物加入供試品中進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗(yàn)，測(cè)試微生物在不同時(shí)間段的存活情況。結(jié)果0.005%的苯扎氯銨對(duì)5種挑戰(zhàn)微生物的生長(zhǎng)有良好的抑制作用，且為最低有效劑量。結(jié)論0.005%的苯扎氯銨可作為0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌劑。

0.1%玻璃酸鈉滴眼液；抑菌效力；苯扎氯銨

目前，眼用制劑大多為多次使用的多劑量包裝，開(kāi)蓋后的反復(fù)使用容易因患者或環(huán)境等因素受到污染，尤其是活性有效成分自身不具有足夠的抑菌或殺菌作用時(shí)，應(yīng)在制劑中添加適宜的抑菌劑。對(duì)于抑菌劑的添加與否、抑菌劑的種類(lèi)和濃度等問(wèn)題，一直是人們持續(xù)關(guān)注的焦點(diǎn)［1～3］。匹配的抑菌劑應(yīng)從安全性、有效性和穩(wěn)定性3個(gè)方面滿(mǎn)足產(chǎn)品的需求，因此，在藥物研發(fā)階段，抑菌效力研究被當(dāng)作處方工藝研究、質(zhì)量研究和標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)眼用制劑研發(fā)也在轉(zhuǎn)型中，已經(jīng)從單方面注重活性有效成分，開(kāi)始全面評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量，包括眼用制劑中抑菌劑的合理使用以及質(zhì)量控制。歐美藥典均登載了研究抑菌劑抑菌效力的方法。參考美國(guó)藥典USP38相關(guān)要求，《中國(guó)藥典》2010年版（二部）附錄列出了抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則，對(duì)相關(guān)制劑包括眼用制劑中添加的抑菌劑進(jìn)行了規(guī)范和約束；《中國(guó)藥典》2015年版［4］參考《歐洲藥典》EP8.5的相關(guān)要求繼續(xù)提高了這方面的標(biāo)準(zhǔn)。

0.1%玻璃酸鈉滴眼液適用于干燥綜合征、干眼綜合征等內(nèi)因性及手術(shù)后、藥物性、外傷、配戴隱形眼鏡等外因性造成的角結(jié)膜上皮損傷，療效良好。我們參考《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌劑濃度進(jìn)行了篩選，對(duì)其抑菌效力進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超凈工作臺(tái)（ESCO，IEC6010－1）；恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋（國(guó)華電器，HH－2）；恒溫?cái)?shù)顯培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)，BSP－250）；離心機(jī)（Spectrafuge，6c）；高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)，YXO－LS－75 SI）；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)，GZX－9140 MBE）；一次性刻度吸管（1、2、10 mL）；一次性培養(yǎng)皿（Sterilin）；接種環(huán)；手動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器（北京賽百奧，XK－97c）；自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器（Interscience，Scan500）；超低溫冰箱（Thermo scientific，700系列）。

1.2 材料 金黃色葡萄球菌（CMCC26003）；銅綠假單胞菌（CMCC10104）；大腸埃希菌（CMCC44102）；白色念珠菌（CMCC98001）；黑曲霉（CMCC98003）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）；大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；Letheen中和肉湯；磷酸鹽緩沖液；0.9%氯化鈉溶液；含聚山梨酯80（Tween 80）的0.9%氯化鈉溶液；0.1%玻璃酸鈉滴眼液（山東省藥學(xué)科學(xué)院）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌液的制備 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌于30～35℃條件下分別培養(yǎng)18～24 h，白色念珠菌于20～25℃條件下培養(yǎng)48～52 h，取各菌用適量無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液洗脫，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中用適量無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液稀釋?zhuān)咕鷳乙簼舛葹?07～108 cfu·mL－1。

黑曲霉于20～25℃條件下培養(yǎng)7 d，用適量含聚山梨酯80的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液洗脫孢子，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，離心（5 000～6 500 rpm×8 min）。棄上清，加適量無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，渦旋混合，使菌懸液濃度為107～108 cfu·mL－1。

2.2 供試品情況 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5，6］，苯扎氯銨對(duì)銅綠假單孢菌和黑曲霉抗菌活性相對(duì)較弱。苯扎氯銨含量高于0.01%時(shí)，對(duì)5種試驗(yàn)菌具較強(qiáng)的殺滅作用，而苯扎氯銨含量等于或低于0.001%時(shí)則對(duì)黑曲霉已經(jīng)基本無(wú)抑制作用。因此，對(duì)苯扎氯銨含量0.01%和0.001%之間的濃度做進(jìn)一步篩選，以濃度具有代表性和易于配制供試品為原則，設(shè)計(jì)0.1%玻璃酸鈉滴眼液中苯扎氯銨的濃度。

設(shè)計(jì)供試品條件：a組（含0.001%苯扎氯銨的供試品）、b組（含0.003%苯扎氯銨的供試品）、c組（含0.005%苯扎氯銨的供試品）、d組（含0.01%苯扎氯銨的供試品）。上述4組供試品，裝量均為5 mL，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液，進(jìn)行抑菌效力試驗(yàn)。

2.3 測(cè)定方法

2.3.1 0 h測(cè)定 各供試品組分別取磷酸鹽緩沖液5支、0.1%玻璃酸鈉滴眼液5支各20 mL，分別依次接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉。接種的菌懸液體積為供試品體積的0.7%。磷酸鹽緩沖液梯度稀釋接種后，取接近的稀釋級(jí)，接種2個(gè)平皿做平行對(duì)照。接種后均放入20～25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在各測(cè)定時(shí)間點(diǎn)時(shí)進(jìn)行梯度稀釋。同時(shí)平行進(jìn)行中和劑驗(yàn)證，菌落回收率不低于70%，說(shuō)明該試驗(yàn)方法及材料均適用于0.1%玻璃酸鈉滴眼液。

2.3.2 6 h測(cè)定 各供試品分別取0.1%玻璃酸鈉滴眼液5支各1 mL，用中和肉湯梯度稀釋?zhuān)舛确弦蟮南♂屢河谄矫笾?，接種2個(gè)平皿做平行對(duì)照，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基。細(xì)菌于30～35℃條件下培養(yǎng)3～5 d，白色念珠菌于20～25℃條件下培養(yǎng)3～5 d，黑曲霉于20～25℃條件下培養(yǎng)3～7 d，并計(jì)菌落數(shù)。

2.3.3 24 h、7 d與28 d測(cè)定 方法同6 h測(cè)定。

2.3.4 測(cè)定時(shí)間及判斷標(biāo)準(zhǔn) 見(jiàn)表1。表中的“減少的lg值”是指各間隔時(shí)間測(cè)定的菌數(shù)lg值與1 mL（g）供試品中接種的菌數(shù)lg值的相差值。表中“A”是指應(yīng)達(dá)到的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，那至少應(yīng)達(dá)到“B”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。

表1 0.1%玻璃酸鈉滴眼液抑菌效力測(cè)試時(shí)間點(diǎn)和判斷標(biāo)準(zhǔn)

2.4 中和劑的驗(yàn)證［4，7］6 h、24 h、7 d、28 d測(cè)定中，需要加入適宜的中和劑消除0.1%玻璃酸鈉滴眼液中剩余的抑菌劑。0 h測(cè)定時(shí)，分別取中和肉湯5支各9 mL，pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液5支各10 mL。在9 mL中和肉湯中分別加入0.1%玻璃酸鈉滴眼液1 mL，中和10 min，作為中和劑對(duì)照組；10 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液作為菌液對(duì)照組，兩組分別加入適宜濃度的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液各0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量不超過(guò)100 cfu，分別取兩組個(gè)試驗(yàn)菌液接種至2個(gè)平皿做平行對(duì)照，加入適宜的培養(yǎng)基，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。中和劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)比值應(yīng)在0.5～2.0之間。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 中和劑的驗(yàn)證結(jié)果 見(jiàn)表2，回收率均大于70%，表明中和肉湯滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，能夠消除滴眼液中殘余的抑菌能力。

表2 中和劑驗(yàn)證菌落數(shù)及結(jié)果

3.2 抑菌效力測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 試驗(yàn)組菌量減少lg值

試驗(yàn)結(jié)果表明，a、b、c、d 4組供試品對(duì)金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用，4組供試品對(duì)銅綠假單孢菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的抑制作用隨抑菌劑濃度的增大而呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，符合《中國(guó)藥典》2015年版判斷標(biāo)準(zhǔn)。其中抑菌劑含量較高的c、d組，與初始值比較，各測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的菌計(jì)數(shù)結(jié)果表現(xiàn)出較為明顯的減少趨勢(shì)，尤其在對(duì)白色念珠菌的抑制作用上。以上4組試驗(yàn)組中，符合《中國(guó)藥典》2015年版抑菌劑效力檢查法結(jié)果判斷“A”標(biāo)準(zhǔn)的有c、d 2組，根據(jù)“所有抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量”［5］這一原則，應(yīng)選取抑菌劑含量最低的c組中的抑菌劑濃度，作為正式產(chǎn)品的處方濃度。

4 討論

《中國(guó)藥典》2015年版更新了抑菌效力檢查法，并根據(jù)歐美藥典的最新要求對(duì)抑菌效力的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高。多劑量包裝的滴眼液需要在處方中適當(dāng)添加適宜的抑菌劑來(lái)保持滴眼液產(chǎn)品在貯存和使用過(guò)程，尤其是使用過(guò)程中具有一定的抑菌能力，同時(shí)考慮添加的抑菌劑多少都會(huì)具有一定的毒性，因此必須進(jìn)行充分的試驗(yàn)研究，嚴(yán)格控制抑菌劑的種類(lèi)和用量，保證用藥安全。

苯扎氯銨為國(guó)內(nèi)外常用的抑菌劑，若不存在嚴(yán)重的配伍禁忌，為大多數(shù)滴眼液中所常用［8］。按照《中國(guó)藥典》2015年版抑菌劑效力檢查法對(duì)0.1%玻璃酸鈉滴眼液中使用苯扎氯銨的濃度進(jìn)行了篩選，最終確定0.005%的苯扎氯銨可用作0.1%玻璃酸鈉滴眼液的抑菌劑。處方中苯扎氯銨濃度為0.005%時(shí)，0.1%玻璃酸鈉滴眼液對(duì)革蘭陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（銅綠假單孢菌和大腸埃希菌）、酵母菌（白色念珠菌）和真菌（黑曲霉）均有較強(qiáng)的抗菌活性，符合《中國(guó)藥典》2015年版抑菌抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)。

［1］ 寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過(guò)程中應(yīng)關(guān)注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42（23）：1836－1838.

［2］ 林吉恒，肖璜，陳萬(wàn)勝，等.氯霉素滴眼劑處方中硫柳汞含量的合理性分析［J］.中國(guó)藥師，2014，7（10）：1687－1690.

［3］ 安彥，唐素芳.地塞米松磷酸鈉滴眼液中兩種抑菌劑的分析［J］.中國(guó)藥業(yè)，2011，20（9）：14－15.

［4］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

［5］ 丁勃，鞏麗萍，謝元超.阿奇霉素滴眼液抑菌劑篩選與抑菌效力研究［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2012，13（4）：281－284.

［6］ 胡小華.阿奇霉素滴眼液的抑菌效力測(cè)定［J］.中國(guó)藥師，2013，16（5）：780－781.

［7］ 李津，宋燕，張世磊.含防腐劑藥物制劑的防腐效力檢測(cè)［J］.食品與藥品，2009，11（6）：56－60.

［8］ 張琳，劉葵葵，王伶.HPLC法同時(shí)測(cè)定阿奇霉素滴眼液中阿奇霉素及苯扎氯銨的含量［J］.齊魯藥事，2012，31（12）：705－707.

Studies on antim icrobial effectiveness of Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）

XIA Xiao-jun1，DONG Ai-mei2，ZHANG Jian-qiang3
（1.The People′s Liberation Army 107 Hospital，Yantai264002，China；2.Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences，Jinan 250101，China；3.Shandong Provincial Key Laboratory of Mucosal and Transdermal Drug Delivery Technology，Jinan 250101，China）

ObjectiveTo investigate the optimal concentration of antimicrobial preservative thatwas added to Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）.MethodsAccording to the characteristic of ingredients，select several concentrations of antimicrobial preservative on the basis of the ingredients of the product.Test the antimicrobial effectiveness of antimicrobial preservatives at different ratio.Inoculate the concentration of testmicroorganisms to the products，then estimate the viable microorganisms in different times.ResultsThe growth of testmicroorganismswere inhibited effectively by Sodium Hyaluronate Eye Drops possess of 0.005%benzalkonium chloride which was also the minimum effective dosage.Conclusion0.005%benzalkonium chloride can be used as antimicrobial preservative for Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）.

Sodium Hyaluronate Eye Drops（0.1%）；Bacteriostatic potency；Benzalkonium chloride

R944.1

A

2095－5375（2015）08－0455－003

夏曉君，女，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，E－mail：xxj＿107＠126.com。