董白霞，葉存喜，韓 瑤，包永琴，蔡素貞，崔月先

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，河北 石家莊050000）

隨著糖尿病發(fā)病率日益升高，其并發(fā)癥糖尿病性視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）嚴重威脅患者生存質(zhì)量。如何早期治療PDR，提高PDR患者的生存質(zhì)量成為當(dāng)前亟待解決的問題。近年來，尋求安全、經(jīng)濟、有效的藥物已成為熱點。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是人體正常飲食中不可缺少的不飽和脂肪酸，可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）特異性flk-1受體抑制體外培養(yǎng)的牛頸動脈內(nèi)皮細胞增殖［1］。我們既往實驗證明，EPA濃度達到0.15g／L時，可以抑制體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細胞增殖［2］；PDR背景期和增殖前期EPA玻璃體注射可以阻斷PDR發(fā)展，對防止PDR新生血管形成有明確治療作用［3］。為了進一步明確EPA對PDR視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)的影響及作用，我們設(shè)計了本實驗，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選8周齡健康Sprague-Dawley（SD）大鼠46只，雌雄各半，體質(zhì)量180～250g，購自河北省實驗動物中心。

1.2 糖尿病模型的建立 46只鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（60mg／kg，用0.01mol／L的枸櫞酸鹽緩沖液溶解、濃度為10g／L），1周后測血糖（美國強生血糖儀）≥13.9mmol／L確定為糖尿病鼠［4］，之后每周測血糖1次，低于13.9mmol／L鼠淘汰出糖尿病組，共注射46只，成模36只，成模率為78.3%。

1.3 分組 上述糖尿病模型大鼠36只分為4組，各組SD大鼠腹腔注射STZ后1個月時846復(fù)合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內(nèi)注射全麻后：①C組12只，VEGF（0.05μg／0.5μL，美國 Sigma公司）＋1.5 μL生理鹽水雙眼玻璃體注射。玻璃體注射VEGF后2周（C1組）、4周（C2組）、8周（C3組）取材，每組4只。②D組12只，VEGF（0.05μg／0.5μL，美國Sigma公司）＋EPA（0.5μg／0.5μL，美國Cayman公司）＋1.0μL生理鹽水雙眼玻璃體注射。玻璃體注射 VEGF后2周（D1組）、4周（D2組）、8周（D3組）取材，每組4只。③E組8只，VEGF（0.05μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射，2周后EPA（0.5μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射。玻璃體注射VEGF后4周（即EPA玻璃體注射后2周）取材為E1組、8周（即EPA玻璃體注射后6周）取材為E2組，每組4只。④F組4只，VEGF（0.05μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射，4周后EPA（0.5μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射。玻璃體注射VEGF后4周（即EPA玻璃體注射后4周）取材為F組。

1.4 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察 玻璃體注射VEGF后2周（C1、D1組）、4周（C2、D2、E1組）、8周（C3、D3、E2、F組）846復(fù)合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內(nèi)注射全麻后每組4只動物，視網(wǎng)膜做電鏡切片，觀察各組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié) 果

2.1 C1組 視細胞內(nèi)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、空泡化；雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫（圖1）；內(nèi)網(wǎng)層空泡變；神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、空泡化，胞漿液化、溶解。

2.2 C2組 視細胞外節(jié)膜盤溶解較重，但內(nèi)節(jié)尚有部分殘留；視桿、視錐細胞外間隙水腫較C1組嚴重，細胞核外膜部分斷裂（圖2）；內(nèi)核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴張。

2.3 C3組 視桿、視錐層溶解、消失；內(nèi)、外核層變薄；可見到碎裂的視桿細胞胞核固縮（圖3）；外網(wǎng)層消失；內(nèi)網(wǎng)層空泡化，胞漿液化、水腫，樹突內(nèi)線粒體腫脹、空泡化；神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)液化、溶解，線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張。病變重于C2組。

2.4 D1組 色素上皮微絨毛短、部分質(zhì)膜內(nèi)褶擴張、部分線粒體空泡化；視細胞外節(jié)膜盤部分溶解，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹、空泡化；外核層細胞胞漿液化、細胞器溶解，外層核膜部分溶解、不連續(xù)（圖4）；內(nèi)網(wǎng)層空泡變；節(jié)細胞胞漿空泡化、胞核正常；神經(jīng)纖維層空泡化、線粒體空泡變。

2.5 D2組 外節(jié)膜盤病變輕于D1組。

2.6 D3組 外節(jié)膜盤病變減輕，輕于D2組（圖5）；視細胞內(nèi)節(jié)線粒體腫脹明顯減輕，較D2組輕；外核層細胞核周隙擴張、核外膜存在，病變較C3組減輕（圖6）；內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層、神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層病變同D1組。

2.7 E1組 外核層細胞核染色體聚集、核固縮，視細胞外節(jié)消失、殘留內(nèi)節(jié)水腫，但重于E2組；色素上皮細胞與視桿、視錐層之間出現(xiàn)膠質(zhì)細胞（視網(wǎng)膜病變時膠質(zhì)細胞易出現(xiàn)于此處）（D1組亦有）。神經(jīng)細胞嚴重變性，內(nèi)核層細胞染色質(zhì)皺縮、胞漿液化，內(nèi)皮細胞核染色質(zhì)皺縮（圖7）；內(nèi)網(wǎng)層空泡化，結(jié)構(gòu)嚴重紊亂，重于E2組；神經(jīng)纖維層液化、溶解。重于E2組。

2.8 E2組 外核層細胞間隙局限性增大，細胞外水腫；較E1組病變輕（圖8）；外節(jié)膜盤局部溶解，內(nèi)節(jié)水腫明顯，較E1組輕；內(nèi)核層細胞病變明顯輕于E1組（圖9）；內(nèi)網(wǎng)層空泡化；神經(jīng)節(jié)細胞胞漿液化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、線粒體腫脹；神經(jīng)纖維層部分線粒體腫脹。2.9 F組 色素上皮細胞內(nèi)初級溶酶體多、次級溶酶體少；微絨毛正常；視桿、視錐層消失（感光細胞代謝降低）；外核層細胞間隙普遍性增大；內(nèi)核層細胞部分核周隙增大（圖10）；內(nèi)網(wǎng)層空泡變（圖11）；神經(jīng)節(jié)細胞胞漿液化、神經(jīng)纖維層空泡變。

圖1 雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫（×10 000）Figure 1 Outer nuclear membrane dissolves，mitochondria swells and cytoplasm expands in bipolar cell（×10 000）

圖2 C2組細胞外間隙水腫較C1組嚴重，細胞核外膜部分斷裂（×12 000）Figure 2 More severe extracellular space dropsy，outer nuclear membrane collapses partly in C2group than in C1group（×12 000）

圖3 碎裂的視桿細胞胞核固縮（×4 000）Figure 3 Karyopyknosis of fragmented rod cell（×4 000）

圖4 外核層細胞胞漿液化（×6 000）Figure 4 Cytoplasm of outer nuclear layer cell diffluences（×6 000）

圖5 D3組外節(jié)膜盤病變減輕，輕于D2組（×6 000）Figure 5 Pathological changes of membranous disc of outer segment in D3group alleviate compared with those in D2group（×6 000）

圖6 D3組外核層細胞核周隙擴張，核外膜存在，病變較C3組減輕（×5 000）Figure 6 Perinuclear cisterna of outer nuclear layer cell becomes enlarged，but outer nuclear membrane complete in D3group，and pathological changes alleviate more than those of C3group（×6 000）

圖7 神經(jīng)細胞嚴重變性，內(nèi)核層細胞染色質(zhì)皺縮、胞漿液化，內(nèi)皮細胞核染色質(zhì)皺縮Figure 7 Nerve cell degenerates severely，chromatin shrinks，cytoplasm diffluences in inner nuclear layer cell；chromatin shrinks in endothelial cell（×5 000）

圖8 E2組外核層細胞間隙局限性增大，細胞外水腫；較E1組病變輕（×4 000）Figure 8 Intercellular space enlarges locally in outer nuclear layer，and extracellular dropsy presents in E2group，the changes more lightly than those in E1group（×4 000）

圖9 E2組內(nèi)核層細胞病變明顯輕于E1組（×4 000）Figure 9 Pathological changes of inner nuclear layer cell in E2group more lightly than those of E1group（×4 000）

圖10 內(nèi)核層細胞部分核周隙增大（×4 000）Figure 10 Perinuclear cisterna enlarges partly in inner nuclear layer cell（×4 000）

圖11 內(nèi)網(wǎng)層空泡變（×6 000）Figure 11 Vacuolization in inner plexiform layer（×6 000）

3 討 論

隨著糖尿病患者數(shù)量在世界范圍內(nèi)的與日俱增，糖尿病性視網(wǎng)膜病變已經(jīng)成為生后最常見的致盲原因。90%以上的糖尿病患者最終會發(fā)生視網(wǎng)膜病變，其中1型糖尿病患者中有60%、2型糖尿病患者中有20%會發(fā)展為PDR［5］。由于目前的治療方法——光凝和玻璃體切除術(shù)勢必會帶來損害并且短期內(nèi)有效，考慮到糖尿病患者的數(shù)量近年來持續(xù)增加，探索新的治療方法迫在眉睫。

VEGF是造成糖尿病性視網(wǎng)膜病變新生血管形成的關(guān)鍵性因子，阻斷其作用理論上可以抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展。目前在脈絡(luò)膜新生血管性疾病的研究中已有3種藥物應(yīng)用于臨床研究階段：Macugen、Lucentis、Avastin。上述3種藥物價格昂貴，均屬于VEGF抗體類藥物，對于視網(wǎng)膜的新生血管性疾病的治療作用尚待進一步探討，因此，探求安全、經(jīng)濟、有效的藥物用于PDR的治療顯得尤為迫切。

EPA作為VEGF受體flk-1的封閉劑［6］，理論上可以達到阻斷糖尿病性視網(wǎng)膜病變的效果［7］；另外，它還是人體中所必須的一種不飽和脂肪酸，廣泛存在于深海魚油中，故對生物體無毒和不良作用，開發(fā)前景廣闊。近年來，EPA受到越來越多國外學(xué)者的關(guān)注。EPA在體內(nèi)可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在體外對VEGF誘導(dǎo)的牛頸動脈內(nèi)皮細胞增殖有抑制作用，其在體內(nèi)抑制腫瘤生長的機制之一有可能是選擇性抑制VEGF的受體flk-1，從而抑制腫瘤的新生血管形成。我們的研究結(jié)果也表明，當(dāng)EPA濃度達到0.15g／L時，可以抑制體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細胞的增殖［2］。而且EPA體內(nèi)應(yīng)用可以防止糖尿病性視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜新生血管形成［3］。此外，EPA對視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)有無改善作用尚不可知，故我們通過電鏡觀察研究了EPA體內(nèi)應(yīng)用對糖尿病性視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的影響。

本研究結(jié)果顯示，C1組出現(xiàn)了多層結(jié)構(gòu)的損傷：視細胞內(nèi)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、空泡化；雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫；神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、空泡化，胞漿液化、溶解。C2組視細胞外節(jié)膜盤溶解較重，但內(nèi)節(jié)尚有部分殘留；視桿、視錐細胞外間隙水腫較C1組嚴重，細胞核外膜部分斷裂；內(nèi)核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴張。C3組視桿和視錐層溶解、消失；內(nèi)、外核層變薄；可見到碎裂的視桿細胞胞核固縮；外網(wǎng)層消失；胞漿液化、水腫，樹突內(nèi)線粒體腫脹、空泡化；神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)液化、溶解，線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張；病變重于C2組。C1、C2、C3組之間比較，C2組病變明顯重于C1組，而C3組出現(xiàn)了視網(wǎng)膜萎縮的改變。

在糖尿病性視網(wǎng)膜病變背景期應(yīng)用EPA玻璃體腔注射后，D1組視網(wǎng)膜外層病變與C1組大致相同，節(jié)細胞可見胞漿空泡化、胞核正常，而C1組節(jié)細胞胞漿液化、溶解。兩組相比病變在節(jié)細胞層有所減輕。D2組視細胞外節(jié)膜盤病變輕于D1組。D3組則外節(jié)膜盤病變、視細胞內(nèi)節(jié)線粒體腫脹程度均較D2組明顯減輕；外核層細胞核周隙擴張，核外膜存在，病變較C3組減輕。

在糖尿病性視網(wǎng)膜病變增殖前期應(yīng)用EPA玻璃體注射后，E1組外核層細胞核染色體聚集、核固縮，視細胞外節(jié)消失，殘留內(nèi)節(jié)水腫，神經(jīng)細胞嚴重變性，內(nèi)核層細胞染色質(zhì)皺縮、胞漿液化，內(nèi)皮細胞核染色質(zhì)皺縮，內(nèi)網(wǎng)層空泡化，結(jié)構(gòu)嚴重紊亂，神經(jīng)纖維層液化、溶解。視網(wǎng)膜各層神經(jīng)細胞病變與C2組大致相同，均重于E2組，此結(jié)果表明，EPA對于糖尿病性視網(wǎng)膜病變時神經(jīng)細胞的損傷在增殖前期給藥后6周時有治療作用，但具體機制有待于進一步探討。

在糖尿病性視網(wǎng)膜病變增殖期應(yīng)用EPA玻璃體注射后，F(xiàn)組視桿、視錐層消失（感光細胞代謝降低），C3組則視細胞外節(jié)膜盤溶解較重，但內(nèi)節(jié)尚有部分殘留；F組外核層細胞間隙普遍性增大；而C3組視桿、視錐細胞外間隙水腫細胞核外膜部分斷裂；F組內(nèi)核層細胞部分核周隙增大，而C3組內(nèi)核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。說明增殖期給予EPA治療后各層神經(jīng)細胞損害有所減輕。EPA在E2組對糖尿病性視網(wǎng)膜病變的效果不如D組和E1組好，但對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)的損害有保護作用；在F組，雖然不能使已有的PDR發(fā)生逆轉(zhuǎn)，但對于視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)的損害也有一定的保護作用。說明EPA除了有封閉flk-1的作用，抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，對神經(jīng)細胞還有保護作用。這與Sangiovanni等［8］的研究結(jié)果一致，但具體機制尚有待于進一步探討。

總之，EPA對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的保護作用：在增殖前期給藥后6周和增殖期給藥后4周對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞損害較未用藥組減輕。說明EPA對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞有明確的保護作用，這是以往抗VEGF抗體所不具備的，因此有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］ Yang SP，Morita I，Murota SI.Eicosapentaenoic acid attenuates vascular endothelial growth factor-induced proliferation via inhibiting Flk-1receptor expression in bovine carotid artery endothelial cells［J］.J Cell Physiol，1998，176（2）：342-349.

［2］ 董白霞，馬景學(xué)，葉存喜，等.二十碳五烯酸對體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細胞增殖抑制效應(yīng)的研究［J］.中華眼科雜志，2007，43（8）：726-733.

［3］ 董白霞，葉存喜，包永琴，等.二十碳五烯酸玻璃體注射治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的實驗研究［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，35（10）：1148-1151.

［4］ Barber AJ，Antonetti DA.Mapping the blood vessels with paracellular permeability in the retinas of diabetic rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（12）：5410-5416.

［5］ Rakoczy PE，Brankov M，F(xiàn)onceca A，et al.Enhanced recombinant adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor expression in the adult mouse retina：apotential model for diabetic retinopathy［J］.Diabetes，2003，52（3）：857-863.

［6］ Morita I.Regulation of angiogenesis-expression of VEGF receptors［J］.Human Cell，1998，11（4）：215-220.

［7］ Ozaki H，Seo MS，Ozaki K，et al.Blockade of vascular endothelial cell growth factor receptor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization［J］.Am J Ophthalmol，2000，156（2）：697-707.

［8］ Sangiovanni JP，Chew EY.The role of omega-3long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina［J］.Prog Retin Eye Res，2005，24（1）：87-138.