馬劍俠，成翕悅，薛 鵬，王 燕，鮑曉雪，李玉坤

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院內(nèi)分泌二科，河北 石家莊050051）

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，持續(xù)高血糖可導(dǎo)致多種慢性并發(fā)癥，糖尿病性骨質(zhì)疏松是其中一種，隨著糖尿病患病率的不斷攀升及人口老齡化進(jìn)程的加快，糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)病率逐年增多。因此，如何防治糖尿病患者骨量丟失逐漸受到重視。在骨質(zhì)疏松發(fā)病過(guò)程中，破骨細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用，本研究建立2型糖尿病大鼠模型，旨在觀察2型糖尿病大鼠破骨細(xì)胞變化及其與血糖的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)近交系雌性Wistar大鼠，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)905105，共40只，體質(zhì)量180～200g，鼠齡2.5～3個(gè)月。常規(guī)飼料購(gòu)自白求恩國(guó)際和平醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高糖高脂飼料為常規(guī)飼料中加入20%蔗糖、15%熟豬油、2.5%膽固醇。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國(guó)Sigma公司）用前以0.1mmol／L、pH 4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解，新鮮配成0.5%STZ溶液，經(jīng)濾菌器除菌。

1.2 方法 將40只2.5～3個(gè)月齡健康雌性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）和2型糖尿病組（DM組）各20只，2組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)期間NC組常規(guī)飼料、DM組高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周，禁食12h后左下腹腔給予STZ 30mg／kg注射。于實(shí)驗(yàn)第9周末選取尾靜脈空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥7.8mmol／L且伴有胰島素抵抗者作為復(fù)制成功的2型糖尿病動(dòng)物模型［1］。

2組分別于造模成功后0、4、8、12周各時(shí)點(diǎn)當(dāng)天清晨禁食狀態(tài)下 內(nèi)眥靜脈取血4mL，離心分離血清（3 000r／min，15min），測(cè)定FBG、血清胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（IAI）=1／FPG（mmol／L）×FINS（mU／L），所得數(shù)值取自然對(duì)數(shù)。造模成功后組大鼠分別于0、4、8、12周各取5只大鼠拉頸處死，75%乙醇浸泡大鼠10～15min。無(wú)菌條件下取股骨，分離周圍組織，切斷股骨兩端骨骺，用含4mLα-MEM注射器沖洗骨髓腔2次，無(wú)菌離心管收集骨髓沖洗液，離心；培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度為1.5×106／mL，將此細(xì)胞懸液置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，0.5mL／孔。培養(yǎng)液為α-MEM，其中含10%胎牛血清、30μg／L sRANKL、10μg／L M-CSF、100U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素；每2～3d更換培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。破骨細(xì)胞染色和計(jì)數(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)7d后，固定細(xì)胞，抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色。TRAP染色陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)≥3個(gè)認(rèn)定為破骨細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下每孔計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)量資料之間的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠FBG、FINS、IAI比較 相同時(shí)間點(diǎn)DM組大鼠FPG、FINS顯著高于 NC組（P＜0.05），DM組IAI明顯低于NC組（P＜0.05），提示DM組大鼠存在胰島素抵抗和高血糖。見表1。

表1 2組FBG、FINS及IAI比較Table 1 Comparison in fast blood glucose，fast insulin and insulin activation index between two groups（n=5，±s）

表1 2組FBG、FINS及IAI比較Table 1 Comparison in fast blood glucose，fast insulin and insulin activation index between two groups（n=5，±s）

?

2.2 2組大鼠破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2.1 破骨細(xì)胞鑒定結(jié)果 倒置相差顯微鏡下活體細(xì)胞觀察，典型的破骨細(xì)胞形態(tài)多種多樣，呈圓形、不規(guī)則形或者葡萄串形，胞體較大，胞核3個(gè)以上甚至更多，可達(dá)百個(gè)。質(zhì)膜邊界不整，周邊可見偽足伸展。TRAP染色表現(xiàn)為TRAP染色酶活性部分酒紅色，顆粒狀，位于胞漿內(nèi)，均勻分布，偽足清晰，核為陰性，核仁清楚。

2.2.2 2組大鼠破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 第4周與第12周DM組大鼠破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于NC組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 2組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較Table 2 The osteoclasts number of two groups（n=5，±s，個(gè)）

表2 2組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較Table 2 The osteoclasts number of two groups（n=5，±s，個(gè)）

?

2.3 破骨細(xì)胞數(shù)量與IAI的相關(guān)分析 造模成功后第4周至第12周，DM組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)量與IAI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.674，P=0.012）。

3 討 論

近年來(lái)的調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)2型糖尿病患病率快速增長(zhǎng)，且年齡越大，患病率越高［2-3］。2型糖尿病影響骨轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性增高［4-5］。因此，如何預(yù)防和延緩糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松尤為重要。目前2型糖尿病對(duì)骨代謝影響的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本研究建立2型糖尿病大鼠模型探討不同時(shí)間正常、糖尿病大鼠血糖、胰島素和破骨細(xì)胞的變化，旨在從細(xì)胞水平為糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

胰島素分泌不足及胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征。糖尿病大鼠模型主要分為2類：遺傳性模型和特殊藥物類模型。遺傳性模型如ob／ob小鼠、NOD鼠、NYS鼠等；特殊藥物類模型是通過(guò)STZ或四氧嘧啶誘導(dǎo)，其起作用機(jī)制都是選擇性破壞胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素不同程度下降和血糖升高。遺傳性模型中遺傳因素占主導(dǎo)地位，與臨床不完全相符，且價(jià)格昂貴，而單純藥物法更傾向于1型糖尿病改變且動(dòng)物死亡率高，其研究?jī)r(jià)值存在一定局限性。應(yīng)用小劑量STZ結(jié)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)，造成大鼠廣泛胰島素抵抗及高血糖，可以復(fù)制出2型糖尿病動(dòng)物模型［6-7］。本研究選用2.5～3個(gè)月齡雌性wiastar大鼠，適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，首先通過(guò)高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周誘發(fā)高胰島素血癥和胰島素抵抗，再注射小劑量STZ（30mg／kg），導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡，胰島素分泌不足，1周后測(cè)空腹血糖≥7.8 mmol／L，最終發(fā)展為高血糖癥。此動(dòng)物模型具有2型糖尿病類似的臨床和生化代謝特征，胰島素抵抗、高血糖、血脂異常等多個(gè)致病因素。該模型相對(duì)簡(jiǎn)單易得，存活時(shí)間長(zhǎng)。

糖尿病患者易發(fā)生骨量丟失和骨折［8］，1型糖尿病導(dǎo)致骨密度減低從而使骨折風(fēng)險(xiǎn)增加［9-10］，而2型糖尿病骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的機(jī)制尚不十分清楚［4，11-12］。在糖尿病所致骨代謝異常發(fā)病過(guò)程中，破骨細(xì)胞起關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖對(duì)破骨細(xì)胞的作用表現(xiàn)為或促進(jìn)或抑制其生成。Wittrant等［13］通過(guò)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高糖通過(guò)抑制核因子κB活性影響RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和分化，降低骨轉(zhuǎn)換。Motyl等［14］研究發(fā)現(xiàn)，高劑量STZ誘導(dǎo)的糖尿病血糖顯著升高，組織蛋白酶K及RANKL／OPG比例增加。表明嚴(yán)重糖尿病高血糖可上調(diào)破骨細(xì)胞活性。孫彥等［15］在葡萄糖對(duì)大鼠破骨細(xì)胞分化影響的研究中發(fā)現(xiàn)葡萄糖呈濃度依賴性上調(diào)破骨細(xì)胞膜RANK mRNA表達(dá)，高糖可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，其促進(jìn)作用始于誘導(dǎo)分化早期。表明骨髓微環(huán)境高糖可能是糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制之一。本研究觀察4、12周2型糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)其破骨細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組大鼠，且隨糖尿病病程進(jìn)展破骨細(xì)胞數(shù)量呈上升趨勢(shì)。表明2型糖尿病高血糖對(duì)破骨細(xì)胞分化有正性調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。本研究結(jié)果支持高血糖促進(jìn)破骨細(xì)胞分化觀點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究都顯示胰島素主要通過(guò)成骨細(xì)胞來(lái)影響骨代謝過(guò)程。一般認(rèn)為，高胰島素對(duì)骨骼具有保護(hù)作用。2型糖尿病患者其胰島素分泌量表現(xiàn)為相對(duì)不足，即初期為高胰島素血癥，后期其分泌量亦顯絕對(duì)不足。故2型糖尿病患者體內(nèi)胰島素水平的波動(dòng)可能是造成其對(duì)骨代謝作用結(jié)果不一致的原因之一。Huang等［16］通過(guò)觀察肝臟胰島素清除受損的LSACC1小鼠發(fā)現(xiàn)，血清BALP和TRACP均下降約60%，破骨細(xì)胞數(shù)也顯著下降。表明高胰島素負(fù)性調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換下降。這種小鼠具有高胰島素血癥特點(diǎn)，但FBG水平正常，去除了高血糖對(duì)骨代謝的影響。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病組胰島素顯著升高同時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量顯著升高，表明高胰島素血癥正性調(diào)節(jié)骨吸收。

本研究2型糖尿病大鼠破骨細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組，說(shuō)明長(zhǎng)期高血糖、高胰島素可促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，使骨吸收大于骨形成繼而造成骨量減少甚至骨質(zhì)疏松，進(jìn)一步表明破骨細(xì)胞與糖尿病骨代謝有關(guān)，在細(xì)胞水平上部分闡明了2型糖尿病骨吸收增強(qiáng)的機(jī)制。

［1］ 王燕，劉巖，何金花，等.去卵巢2型糖尿病大鼠骨骼肌磷酯酰肌醇3-激酶、絲氨酸／蘇氨酸激酶2及核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B的表達(dá)［J］.中華糖尿病雜志，2013，5（10）：618-623.

［2］ Yang SH，Dou KF，Song WJ.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362（25）：2425-2426.

［3］ Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults［J］.JAMA，2013，310（9）：948-959.

［4］ Carnevale V，Romagnoli E，D′Erasmo L，et al.Bone damage in type 2diabetes mellitus［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2014［Epub ahead of print］.

［5］ Jiajue R，Jiang Y，Wang O，et al.Suppressed bone turnover was associated with increased osteoporotic fracture risks in non-obese postmenopausal Chinese women with type 2diabetes mellitus［J］.Osteoporos Int，2014，25（8）：1999-2005.

［6］ 武燕，袁紅，田環(huán)環(huán)，等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型的探索［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（1）：25-27.

［7］ 張毅，李慧穎，董玲，等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)模擬2型糖尿病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.中華糖尿病雜志，2011，3（5）：433-435.

［8］ Jackuliak P，Payer J.Osteoporosis，fractures，and diabetes［J］.Int J Endocrinol，2014［Epub ahead of print］.

［9］ Dhaon P，Shah VN.Type 1diabetes and osteoporosis：a review of literature［J］.Indian J Endocrinol Metab，2014，18（2）：159-165.

［10］ Pan H，Wu N，Yang T，et al.Association between bone mineral density and type 1diabetes mellitus：a meta-analysis of cross-sectional studies［J］.Diabetes Metab Res Rev，2013［Epub ahead of print］.

［11］ 李瑞霄，薄德峰，曹文功，等.胰島素樣生長(zhǎng)因子1與2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松的相關(guān)性探討［J］.臨床薈萃，2014，29（1）：66-67.

［12］ 王庭俊，王中心，陳純嫻.2型糖尿病胱抑素C與骨質(zhì)疏松的關(guān)系［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（11）：1290-1293.

［13］ Wittrant Y，Gorin Y，Woodruff K，et al.High d（＋）glucose concentration inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis［J］.Bone，2008，42（6）：1122-1130.

［14］ Motyl K，McCabe LR.Streptozotocin，type I diabetes severity and bone［J］.Biol Proced Online，2009，11：296-315.

［15］ 孫彥，李興，朱亦.葡萄糖對(duì)大鼠骨髓破骨細(xì)胞分化的影響［J］.臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志，2007，16（3）：171-174.

［16］ Huang S， Kaw M， Harris MT，et al.Decreased osteoclastogenesis and high bone mass in mice with impaired insulin clearance due to liver-specific inactivation to CEACAM1［J］.Bone，2010，46（4）：1138-1145.