逯嶺松，劉 蓓，馬 霄，虞 成，吳 舜，冷建杭△

（1．浙江省杭州市第一人民醫(yī)院中心實驗室 310006；2．浙江大學醫(yī)學院

附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳科，浙江杭州310006）

髓過氧化物酶（MPO）是由活化中性粒細胞、單核細胞及組織巨噬細胞顆粒釋放的一種含血紅素的過氧化物酶［1］。大量研究發(fā)現(xiàn)，血清MPO能在未發(fā)生心肌壞死的情況下預測不良心臟事件的危險性及在隨后的1～6個月內(nèi)發(fā)生嚴重心血管疾病的危險性，是心血管疾病風險的獨立預測因子［2－3］。因此，MPO的檢測在心血管疾病的早期臨床診斷中起著重要的作用。目前，MPO的常規(guī)檢測方法，如放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），具有一定的靈敏度和特異性，但是操作繁瑣、耗時，需要精密的儀器和專業(yè)人員。針對以上不足，本研究通過將MPO抗體固定在石墨化多孔碳－金納米粒子（AuNPs＠GMCs）復合材料修飾的玻碳電極表面，研制了一種MPO電化學免疫傳感器，并對傳感器的性能進行評價，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 試劑 MPO抗原、MPO抗體、牛血清清蛋白（BSA，96%～99%）、殼聚糖（CS）、氯金酸、石墨化多孔碳（GMCs，球體直徑330nm，孔徑137埃）購買于美國Sigma公司。人髓過氧化物酶ELISA試劑盒購買于上海滬峰生物科技有限公司。1，6－己二硫醇［HS（CH2）6SH，97%］購買于上海生工生物有限公司。實驗所用緩沖液均為含5mmol／L ［Fe（CN）6］3－／4－和0．1 mol／L KCl的0．1mol／L PBS溶液（pH 7．0），實驗用水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

1．2 儀器 CHI 6043D電化學工作站，玻碳電極（GC，工作電極），鉑絲（對電極），Ag／AgCl電極（參比電極），LIBROR AEL－200電子天平，BRANSON B3200S－T恒溫超聲儀，BIORAD全自動酶免分析儀。

1．3 實驗方法

1．3．1 納米金（AuNPs）的制備 采用經(jīng)典檸檬酸鈉還原法制備AuNPs溶液，并用透射電子顯微鏡對其進行表征。

1．3．2 GMCs包裹的納米金懸液（AuNPs＠GMCs）的制備將適量GMCs置于含2mmol／L HS（CH2）6SH 的乙醇溶液中，室溫24h以上，使其表面富含巰基（－SH）。用乙醇和雙蒸水反復清洗預處理后的GMCs并用氮氣干燥，然后將富含－SH的GMCs粉末置于AuNPs溶液中10h，使其通過－SH吸附AuNPs。隨后用吸管盡可能多地吸掉上清液，去除未結(jié)合的AuNPs，使用雙蒸水清洗，氮氣下干燥后即制得AuNPs＠GMCs粉末。將殼聚糖粉末置于1．0%（v／v）的醋酸溶液中，室溫超聲30min后制得0．5mg／mL的殼聚糖溶液。然后將AuNPs＠GMCs粉末加入到0．5mg／mL的殼聚糖溶液中超聲后得到2．0mg／mL黑色AuNPs＠GMCs懸液。

1．3．3 MPO免疫傳感器的制作 玻碳電極經(jīng)0．3μm、0．05 μm鋁粉拋光至鏡面以充分去除電極表面的雜質(zhì)，依次置于雙蒸水、乙醇、雙蒸水中超聲清洗5min，晾干待用。將5μL的AuNPs＠GMCs懸液滴涂于預處理的玻碳電極表面，室溫晾干，置于MPO溶液中于4℃過夜。最后在室溫下將電極浸入2．5g／L的BSA溶液中1h，以封閉電極上的非特異性吸附位點，制成MPO電化學免疫傳感器，4℃下保存?zhèn)溆?。該傳感器的制作流程如圖1所示。

圖1 MPO電化學免疫傳感器的制作流程

1．4 檢測方法 在三電極體系下，將制備好的免疫傳感器置于含5mmol／L［Fe（CN）6］3－／4－和0．1mol／L KCl的0．1mol／L PBS溶液（pH 7．0）中，記錄電極穩(wěn)定時的空白電流值I0。按照一定的比例稀釋MPO標準品，配成不同濃度的MPO標準溶液，將修飾電極置于不同濃度的MPO標準溶液中37℃反應20min后，再在工作溶液中進行差分脈沖伏安測試，記錄穩(wěn)定后的電流值I1。根據(jù)不同濃度的MPO所對應的電流差值ΔI（ΔI＝I0－I1）繪制標準曲線。

1．5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 采用商品化人 MPO ELISA試劑盒嚴格按照試劑盒說明書操作步驟對25例血清樣品（來自杭州市第一人民醫(yī)院）進行檢測。

2 結(jié) 果

2．1 AuNPs＠GMCs復合納米材料的表征 通過透射電子顯微鏡對AuNPs＠GMCs進行表征，結(jié)果如圖2所示。GMCs呈三維有序球形多孔結(jié)構，AuNPs分散較好，平均直徑為20 nm，均勻吸附在GMCs上。

2．2 實驗條件優(yōu)化 本實驗分別對檢測溶液的pH、免疫反應溫度和時間進行了優(yōu)化。從圖3可以看出，當工作溶液的pH達到7．0、孵育溫度為37℃、孵育20min時，傳感器的性能達到最佳狀態(tài)。

圖2 透射電鏡圖像

圖3 實驗條件

2．3 標準曲線 配置300．000、100．000、50．000、25．000、12．500、6．250、3．125、2．000ng／mL 8個不同濃度的 MPO 標準溶液，使用制備好的傳感器對其進行檢測，分別記錄電流變化值ΔI，繪制標準曲線（圖4）。結(jié)果表明，MPO濃度在2．000～300．000ng／mL范圍內(nèi)與ΔI成良好的線性關系，線性方程為：Y＝12．980＋0．234 X，線性相關系數(shù)r＝0．999。將傳感器在空白溶液中連續(xù)掃描10次，根據(jù)3倍空白標準差與斜率的比值得出其檢出限為0．5ng／mL。

圖4 MPO濃度與峰電流的線性關系

2．4 臨床應用 使用本實驗制備好的MPO電化學免疫傳感器檢測了25例臨床血清標本，同時采用標準ELISA法進行平行試驗。圖5為兩種方法檢測結(jié)果的相關性分析，由圖可知，兩種方法檢測結(jié)果的相關系數(shù)為0．983（y＝2．711＋0．977x。

x：ELISA；y：免疫傳感器）。

圖5 電化學免疫傳感器與ELISA法血清樣本檢測結(jié)果相關性分析

3 討 論

電化學免疫傳感器將電化學檢測技術和抗原抗體特異性反應原理結(jié)合在一起，通過將生物反應信號轉(zhuǎn)化為電化學信號，可實現(xiàn)對靶物質(zhì)的定量檢測。與傳統(tǒng)的免疫分析技術比較，電化學免疫傳感器不僅具有免疫反應的高特異性，而且結(jié)合了電化學檢測技術的高靈敏性。由于電化學免疫傳感器具有便攜、成本低、操作方便、反應時間短等優(yōu)勢，使其備受關注并在疾病標志物檢測領域得到廣泛應用［4－5］。目前，將電化學免疫傳感器應用于MPO檢測的報道尚不多見［6－9］。

制備免疫傳感器的關鍵問題：（1）如何保持抗體在電極表面的活性？因為這不僅關系到檢測結(jié)果的可靠性，還會影響傳感器的再生能力。MPO抗體作為一種蛋白質(zhì)，只有在具有良好生物相容性的環(huán)境中才能最大地保持其生物活性。由于AuNPs具有較大的比表面積、良好的生物相容性及較高的表面自由能，使其不僅能夠牢固地吸附抗體、增大抗體的負載量，而且能夠保持抗體的活性［10－12］。（2）如何放大檢測信號，提高電流響應？這將直接影響傳感器的檢測靈敏度。GMCs具有較強的電子傳導能力、石墨樣結(jié)構及有效的吸附和去吸附能力等優(yōu)點［13－15］，能夠極大地放大電流信號，提高免疫傳感器的檢測靈敏度。

本實驗采用AuNPs＠GMCs復合納米材料修飾電極，一方面可以保持MPO抗體的活性，另一方面可以促進電子傳遞，極大地提高電流響應，增加檢測靈敏度。為了使傳感器發(fā)揮最佳性能，本實驗對檢測條件進行了優(yōu)化。從圖3可知，當工作溶液的pH為7．0時，免疫傳感器在37℃環(huán)境下和抗原溶液一起孵育20min時，傳感器的電流響應最大。在最優(yōu)實驗條件下，該電化學免疫傳感器對MPO響應良好，表現(xiàn)出較寬的檢測范圍。MPO濃度在2．000～300．000ng／mL范圍內(nèi)與ΔI呈現(xiàn)良好的線性關系，線性相關系數(shù)達到0．999，且該傳感器檢出限較低，可以達到0．500ng／mL，說明該傳感器的靈敏度較高。另外，本實驗使用制備好的MPO電化學免疫傳感器檢測了25例臨床血清標本，并與標準ELISA進行相關性分析。由圖5可知，2種方法檢測結(jié)果的相關系數(shù)為0．983，結(jié)果令人滿意。

綜上所述，本實驗制備的電化學免疫傳感器具有良好的性能，在檢測MPO方面表現(xiàn)出較寬的線性范圍和較低的檢出限，可實現(xiàn)MPO的超靈敏檢測，對心血管疾病患者的早期診斷具有重要的意義。

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