任嬡姝，付 鋼 ，邱 雨，何 科

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院：1．正畸科；2．口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3．VIP中心 400015）

正畸力作用下牙周組織的改建是正畸治療的生物學(xué)基礎(chǔ)。牙周組織如何將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為組織的生化反應(yīng)，何種控制因子在機(jī)械應(yīng)力促發(fā)細(xì)胞反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，目前的研究還沒(méi)有完全明了。在正畸力作用下壓力側(cè)牙周膜發(fā)生血管受壓、管壁斷裂等血管反應(yīng)，導(dǎo)致血供減少，形成了缺氧的微環(huán)境。有學(xué)者推測(cè)，氧分壓的改變可能是牙周組織改建中潛在的扳機(jī)點(diǎn)。牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells）是牙周組織中最主要的細(xì)胞成分，有研究表明，應(yīng)力刺激可以調(diào)節(jié)其骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κb受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor－κb ligand，RANKL）等破骨細(xì)胞分化調(diào)控蛋白的表達(dá)［1－4］，影響牙槽骨吸收進(jìn)程，而缺氧環(huán)境是否能改變?cè)摷?xì)胞OPG、RANKL的表達(dá)，在國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)缺氧條件下體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells）OPG、RANKL mRNA 表達(dá)的變化，為揭示缺氧在正畸牙移動(dòng)壓力側(cè)骨吸收中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取11～14歲因正畸拔除的健康前磨牙，用加有雙抗（100U／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素）的PBS緩沖液沖洗3次，去除殘留血跡及附著的牙齦軟組織，1mg／mLⅠ型膠原酶（Gibco）消化37℃，1h，吸取消化液，離心，去上清液，將牙周膜碎片均勻放置于培養(yǎng)瓶底，加入含10%FBS（Gibco公司）的DMEM（Gibco公司）培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，95%空氣）中培養(yǎng)4h，待組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)到覆蓋培養(yǎng)瓶底80%時(shí)，去除組織碎片，使用0．1%EDTA、0．25%胰酶（Sigma公司）消化收集細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。取3～5代人牙周膜細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱中，O2濃度設(shè)定為2%（缺氧狀態(tài)），對(duì)照組細(xì)胞仍置于CO2培養(yǎng)箱中，O2濃度為20%（常氧狀態(tài)）。在培養(yǎng)3、6、12和24h后，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1．2 方法 對(duì)培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞，用Trizol（Invitrogen公司）提取細(xì)胞總RNA，用RT－PCR試劑盒（Takara公司）將2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取5μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。OPG的上游引物設(shè)計(jì)為：5′－TCA GTT TGT GGC GAA TAA－3′，下游引物設(shè)計(jì)為：5′－TTG GAC CTG GTT ACC TAT C－3′，片段長(zhǎng)度為197bp；RANKL的上游引物設(shè)計(jì)為：5′－TGC CAA CAT TTG CTT TCG－3′，下游引物設(shè)計(jì)為：5′－CCT CCT TTC ATC AGG GTA T－3′，片段長(zhǎng)度為126bp；β－actin的上游引物設(shè)計(jì)為：5′－CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT－3′，下游引物設(shè)計(jì)為：5′－GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC－3′，片段長(zhǎng)度為268bp。將反應(yīng)產(chǎn)物取5μL作1．5%瓊脂糖凝膠電泳，運(yùn)用Bio－Rad凝膠掃描及圖像分析系統(tǒng)，采集OPG、RANKL和βactin條帶灰度值，計(jì)算同次電泳所得 OPG／β－actin、RANKL／β－actin的比值，并計(jì)算RANKL／OPG的比值。各實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)3次，取平均值。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，所有計(jì)量資料以x±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率比較，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

缺氧（2%O2濃度）培養(yǎng)3、6、12和24h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況和細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。由OPG的RTPCR產(chǎn)物電泳條帶可見(jiàn)，缺氧環(huán)境可以抑制人牙周膜細(xì)胞的OPG基因表達(dá)，隨著缺氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，人牙周膜細(xì)胞的OPG基因表達(dá)水平逐漸降低（圖1A）。電泳條帶灰度值計(jì)算顯示：缺氧培養(yǎng)3、6h后，人牙周膜細(xì)胞的OPG基因表達(dá)輕度減少，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），缺氧培養(yǎng)12h和24h后，人牙周膜細(xì)胞的OPG基因表達(dá)進(jìn)一步減少，明顯低于對(duì)照組（P＜0．05），見(jiàn)圖1C。由RANKL的RTPCR產(chǎn)物電泳條帶可見(jiàn)，缺氧環(huán)境可以促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的RANKL基因表達(dá)，隨著缺氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，人牙周膜細(xì)胞的RANKL基因表達(dá)水平逐漸升高（圖1B）。電泳條帶灰度值計(jì)算顯示：缺氧培養(yǎng)3、6h后，人牙周膜細(xì)胞的RANKL基因表達(dá)輕度增加，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），缺氧培養(yǎng)12h和24h后，人牙周膜細(xì)胞的RANKL基因表達(dá)進(jìn)一步增加，明顯高于對(duì)照組（P＜0．05），見(jiàn)圖1C。

計(jì)算RANKL／OPG比值可見(jiàn)，缺氧環(huán)境可以升高人牙周膜細(xì)胞的RANKL／OPG比值，隨著缺氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，人牙周膜細(xì)胞的RANKL／OPG比值逐漸升高（圖2）。缺氧培養(yǎng)3、6h后，人牙周膜細(xì)胞的RANKL／OPG比值輕度增加，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），缺氧培養(yǎng)12h和24h后，人牙周膜細(xì)胞的RANKL／OPG比值顯著增加，明顯高于對(duì)照組（P＜0．05）。

圖1 缺氧對(duì)人牙周膜細(xì)胞OPG、RANKL基因表達(dá)的影響

圖2 缺氧對(duì)人牙周膜細(xì)胞RANKL／OPG比值的影響

3 討 論

正畸力作用下牙周組織的改建是正畸治療的生物學(xué)基礎(chǔ)。其中，牙槽骨的改建是牙周組織改建的中心環(huán)節(jié)，由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成以及破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收是骨改建的2個(gè)基本過(guò)程。牙周膜細(xì)胞是牙周組織中最主要的細(xì)胞成分，有研究表明，牙周膜細(xì)胞在受到應(yīng)力刺激后，可以向成骨細(xì)胞分化［5］。另外，牙周膜細(xì)胞也可表達(dá)與破骨細(xì)胞相關(guān)的各種調(diào)控蛋白［6］，由此可見(jiàn)，牙周膜細(xì)胞在牙槽骨的改建中有著不可忽視的作用。

氧是生命活動(dòng)所必需的環(huán)境因素，其濃度對(duì)機(jī)體細(xì)胞、組織的功能活動(dòng)具有重要影響。在正畸力作用下壓力側(cè)牙周膜發(fā)生血管受壓、管壁斷裂等血管反應(yīng)，導(dǎo)致血供減少，形成了缺氧的微環(huán)境。近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)牙周膜細(xì)胞在缺氧刺激下的生物學(xué)效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了較多研究。Motohira等［7］對(duì)缺氧環(huán)境下牙周膜細(xì)胞骨吸收相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)缺氧促進(jìn)牙周膜細(xì)胞 VEGF、IL－6、IL－1β基因和蛋白的表達(dá)。Amemiya等［8］對(duì)缺氧環(huán)境下牙周膜細(xì)胞成骨能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)缺氧可以上調(diào)牙周膜細(xì)胞ALP、BSP、VEGF等mRNA的表達(dá)。侯超等［9］研究發(fā)現(xiàn)缺氧可以上調(diào)人牙周膜細(xì)胞HIF－1α蛋白表達(dá)水平，同時(shí)促進(jìn)VEGF基因和蛋白的表達(dá)。Chae等［10］研究發(fā)現(xiàn)缺氧可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞IL－1β、IL－6、IL－8和VEGF的mRNA表達(dá)，并且缺氧與機(jī)械壓應(yīng)力對(duì)牙周膜細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有協(xié)同作用。Kitase等［11］利用基因芯片技術(shù)對(duì)缺氧條件下牙周膜細(xì)胞基因表達(dá)變化進(jìn)行了研究，共發(fā)現(xiàn)11種基因表達(dá)發(fā)生顯著性變化。

在多種破骨細(xì)胞分化調(diào)控蛋白中，RANKL被認(rèn)為是介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、活化的關(guān)鍵因子［12－13］。它能刺激破骨細(xì)胞的分化、活化，抑制破骨細(xì)胞凋亡，而OPG則通過(guò)阻斷RANKL的功能，抑制破骨細(xì)胞的分化和活化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡［14－15］。OPG與RANKL的比值決定破骨細(xì)胞的成熟及功能狀態(tài)。應(yīng)力刺激下，牙周膜細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá)變化已被較多文獻(xiàn)證實(shí)［1－4］，而在缺氧環(huán)境下，牙周膜細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá)變化，在國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中作者采用2%氧濃度作為實(shí)驗(yàn)條件，研究缺氧條件下人牙周膜細(xì)胞OPG、RANKL基因表達(dá)的變化。在缺氧對(duì)細(xì)胞增殖和功能影響的體外研究中，采用何種氧濃度最為合適，目前還沒(méi)有定論。國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用較多的氧濃度常為5%、2%或1%。本實(shí)驗(yàn)中2%氧濃度處理24h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況和細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，未出現(xiàn)細(xì)胞大面積脫落、壞死等現(xiàn)象，細(xì)胞缺氧處理模型建立成功。研究結(jié)果顯示，2%O2濃度培養(yǎng)12h和24h后，人牙周膜細(xì)胞的OPG基因表達(dá)降低，而RANKL基因表達(dá)升高，RANKL／OPG的比值升高，說(shuō)明缺氧環(huán)境可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，這與有的研究者等［7，10］發(fā)現(xiàn)缺氧促進(jìn)牙周膜細(xì)胞IL－6、IL－1β等骨吸收促進(jìn)因子的表達(dá)所反映的規(guī)律一致，即缺氧可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞表達(dá)破骨細(xì)胞分化調(diào)控蛋白，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的成熟和功能狀態(tài)，這與臨床上觀察到的正畸牙移動(dòng)壓力側(cè)骨吸收的情況一致。正畸牙移動(dòng)的骨機(jī)械化學(xué)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，牙齒受力時(shí)局部牙周組織血氧張力會(huì)發(fā)生改變，張力側(cè)血氧張力上升有利于成骨細(xì)胞分化，壓力側(cè)血氧張力下降可引起破骨細(xì)胞分化，本研究結(jié)果與該理論相符，由此推測(cè)氧分壓的改變?cè)谡麘?yīng)力促發(fā)細(xì)胞反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。在后續(xù)研究中，作者將進(jìn)一步探討不同氧濃度對(duì)牙周膜細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響，以及缺氧影響OPG、RANKL表達(dá)的分子機(jī)制，以期更深入地揭示缺氧在正畸牙槽骨改建中的重要作用，為豐富正畸牙移動(dòng)的理論提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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