宋敬，張卓然，李越，韓世愈

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,a 婦產(chǎn)科,b藥學(xué)部,哈爾濱 150001；2.黑龍江省醫(yī)院婦產(chǎn)科)

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·基礎(chǔ)研究·

P15基因抑制宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的體外實驗研究

宋敬1a，張卓然1b，李越2，韓世愈1a

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,a 婦產(chǎn)科,b藥學(xué)部,哈爾濱 150001；2.黑龍江省醫(yī)院婦產(chǎn)科)

[摘要]目的探討P15基因轉(zhuǎn)染對宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響。方法脂質(zhì)體介導(dǎo)將pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，穩(wěn)定篩選后用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的P15的表達(dá)。根據(jù)轉(zhuǎn)染的不同實驗分為空白組、空載體轉(zhuǎn)染組及p15 轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞劃痕實驗檢測P15對Hela細(xì)胞遷移的影響；Transwell小室實驗檢測P15對Hela細(xì)胞侵襲的影響。 結(jié)果RT-PCR 發(fā)現(xiàn)空白組與空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的p15 基因 mRNA 無表達(dá)，p15 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞p15mRNA 高表達(dá)；三組細(xì)胞0 h劃痕寬度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，48 h后P15轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度明顯變窄，小于空白組及空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，空白組及空載體轉(zhuǎn)染組劃痕寬度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。48 h后P15轉(zhuǎn)染組的穿透細(xì)胞數(shù)明顯少于空白組及空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，空白組及空載體轉(zhuǎn)染組穿透細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。結(jié)論P15能夠明顯的抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲。

[關(guān)鍵詞]宮頸腫瘤；HeLa細(xì)胞；轉(zhuǎn)染;細(xì)胞運動

宮頸癌是慢性演變過程，多種因素及多種基因參與其中，使宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展呈多步驟、多階段的過程[1]。宮頸癌細(xì)胞侵襲性較強，目前已知其與細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子、Bcl-2、Caspase、Smac/DIABLO等基因有關(guān)，近來研究發(fā)現(xiàn)，P15與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切。李霞[2]的研究結(jié)果顯示，P15基因與宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移及病人的生存期顯著相關(guān)。P15基因最早研究其在細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)生負(fù)性作用，且在多種器官腫瘤中 P15基因呈現(xiàn)出不同程度的缺失、重排、突變[3-5]。本次研究通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P15基因，觀察其對宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲性的影響。

1材料與方法

1.1研究材料真核表達(dá)質(zhì)粒 pCMV5-p15(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重點實驗室贈)，pcDNA3.1(+)-p15(本院實驗室克隆)，Hela細(xì)胞株(上海博谷生物科技有限公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000(碧云天生物技術(shù)研究所)，CO2培養(yǎng)箱(Bekman，美國)，倒置顯微鏡及攝像器材(Nikon，日本)，Transwell小室(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞，培養(yǎng)基為10%小牛血清的1640，環(huán)境控制為 37 ℃、5% CO2飽和濕度，1~2 d換液1次，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及培養(yǎng)液情況，細(xì)胞鋪滿60%~70%傳代，第N+3-+4代用于繼續(xù)實驗。

1.2.2RT-PCR細(xì)胞總RNA用TRIzol試劑盒提取，引物序列見表1。反應(yīng) 35 個循環(huán)，56 ℃退火。

表1　P15及actin的引物序列與長度

1.2.3基因轉(zhuǎn)染

1.2.3.1分組本實驗分為 3 組。①空白組：未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞；②空載體轉(zhuǎn)染組：用pcDNA3.1(+)-neo 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞；③p15 轉(zhuǎn)染組：用pcDNA3.1(+)-p15轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。

1.2.3.2轉(zhuǎn)染方法參照 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染 48 h 后進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后篩選陽性細(xì)胞培養(yǎng)，達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后進(jìn)行實驗。

1.2.4劃痕實驗在6孔板背面用marker筆以每1厘米寬度橫穿過孔劃橫線標(biāo)記，每孔5條線，用直尺標(biāo)記成平行線，無菌操作接種細(xì)胞，選取對數(shù)生長的細(xì)胞，直尺邊緣與標(biāo)記線重疊，使用無菌槍頭比著直尺在板內(nèi)沿著標(biāo)記線劃痕，用PBS沖洗細(xì)胞3遍，加入1 mL無血清1640培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中孵育。分別于0 h、48 h時后取樣，倒置顯微鏡下測量劃痕寬度，并拍照。

1.2.5Transwell小室實驗制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL。包被基底膜：Matrigel膠4℃過夜融化備用，用 4 ℃預(yù)冷的無血清1640培養(yǎng)基 1∶3稀釋 Matrigel 至終濃度為 1 mg/mL，冰上操作；滅菌槍頭包被小室的底部，37 ℃靜置1h，使其干成膠狀。取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell上室，下室加入500 μL的1640培養(yǎng)液，消除培養(yǎng)液與基質(zhì)膠間的氣泡。于48 h時后取樣，吸出chamber上室液體，無菌鑷子取出chamber，移至800 μL甲醇溶液內(nèi)，室溫固定 30 min。從甲醇溶液中取出 chamber，吸干甲醇溶液，移至800 μL結(jié)晶紫染色液中，室溫染色 30 min，后用去離子水輕輕沖洗，吸干液體，棉棒擦去chamber上室表面的Matrigel膠。倒置顯微鏡下隨機取 5視野，并計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPPS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1Hela細(xì)胞 P15 mRNA 表達(dá)檢測 RT-PCR 發(fā)現(xiàn)空白組與空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的P15 基因 mRNA 無表達(dá)，P15 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞P15mRNA 高表達(dá)，見圖1。

2.2三組細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果三組細(xì)胞0 h劃痕寬度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，48 h后P15轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度明顯變窄，小于空白組及空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，空白組及空載體轉(zhuǎn)染組劃痕寬度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。三組細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果見圖2。

2.3三組細(xì)胞Transwell實驗結(jié)果48 h后P15轉(zhuǎn)染組的穿透細(xì)胞數(shù)明顯少于空白組及空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，空白組及空載體轉(zhuǎn)染組穿透細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。三組細(xì)胞Transwell小室實驗結(jié)果見圖3。

3討論

控制腫瘤的轉(zhuǎn)移是提高宮頸癌生存率的主要方法之一[6]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移受多種因素調(diào)節(jié)，多種基因參與其中。P15基因最早發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，其主要作用是抑制細(xì)胞周期素依賴激酶 4/6(CDK4/6)活性，對細(xì)胞增殖周期進(jìn)行調(diào)控。近年來發(fā)現(xiàn)P15基因與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切。Kim等[7]研究了p15在宮頸癌中的作用，表明P15基因的缺失與宮頸癌關(guān)系密切。鄭金鋒等[8]研究p15蛋白在子宮頸癌中的表達(dá)特點，結(jié)果顯示P15蛋白在宮頸癌組織的表達(dá)率為17.07%(7/41)，明顯低于在正常宮頸組織中的表達(dá)率96.67%(29/30)，P15蛋白陽性表達(dá)率與宮頸癌組織的病理學(xué)分級有關(guān)，P15與宮頸癌病理學(xué)分級存在相關(guān)性。說明抑癌基因P15的表達(dá)缺失與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和評估子宮頸癌惡性程度具有重要意義。李霞[2]的研究有著相似結(jié)果，P15基因產(chǎn)物的陽性表達(dá)率為55.6%(20/36)，其表達(dá)率與宮頸癌病理類型無顯著關(guān)系，但與宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移及病人的生存期顯著相關(guān)，P15基因表達(dá)產(chǎn)物可以作為判斷宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)。本次研究揭示了P15基因與宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲的關(guān)系，結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染P15的宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力明顯降低，提示P15基因不但參與了腫瘤的生長周期的調(diào)控，更參與了腫瘤的侵潤及轉(zhuǎn)移，其有望成為宮頸癌新的治療途徑。

(本文圖1~3見插圖1-2)

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(收稿日期：2014-11-26)

中圖分類號：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.018

作者簡介：宋敬，副主任醫(yī)師，Email:hydsysj@126.com

基金項目：黑龍江省青年科學(xué)基金資助(QC2013C105)