熊園園,李中南，劉珊珊，張帆，張培培

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；3.安徽省省直機(jī)關(guān)醫(yī)院)

?

·基礎(chǔ)研究·

丹蛭降糖膠囊對(duì)糖尿病大鼠腎組織核轉(zhuǎn)錄因子κB表達(dá)的影響

熊園園1,李中南2，劉珊珊2，張帆2，張培培3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；3.安徽省省直機(jī)關(guān)醫(yī)院)

[摘要]目的探討核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)在糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)水平及丹蛭降糖膠囊(DJC)的調(diào)節(jié)作用。方法取55只健康雄性大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組，即健康對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。健康對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組予高脂飼料喂養(yǎng)。采用鏈尿佐菌素(STZ)單次腹腔注射35mg/kg，建立糖尿病動(dòng)物模型，造模成功后，再將實(shí)驗(yàn)組按數(shù)字表法隨機(jī)分為丹蛭高劑量組,丹蛭低劑量組,吡咯列酮組和模型組。除模型組和對(duì)照組外，各組連續(xù)灌胃藥物8周，丹蛭高、低劑量組分別按1.08 g·kg-1·d-1、0.54 g·kg-1·d-1灌胃，吡格列酮組按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康對(duì)照組和模型組按5 mL·kg-1·d-1給予0.9%氯化鈉注射溶液灌胃。免疫組織化學(xué)法檢測NF-κB在腎臟中的表達(dá)水平，并測定各組大鼠血糖。結(jié)果模型組的NF-κB的表達(dá)明顯升高，與健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；丹蛭高、低劑量組灌胃8周后，兩組NF-κB的高表達(dá)明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。丹蛭降糖膠囊灌胃2周后，血糖顯著下降，與模型組比較(P<0.01)，4~8周后血糖指標(biāo)下降平穩(wěn)(P<0.01)。結(jié)論丹蛭降糖膠囊可降低2型糖尿病大鼠血糖和抑制腎組織NF-κB的高表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]糖尿病腎?。籒F-κB；降血糖藥(中藥);模型,動(dòng)物

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，研究表明，炎癥機(jī)制在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，有學(xué)者提出把糖尿病腎病看作一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病[1]。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與了炎癥和凋亡等病理生理過程，與此同時(shí)NF-κB信號(hào)途徑在胰島素抵抗發(fā)生機(jī)制中有著非常重要作用，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化與炎性反應(yīng)及胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)[2-5]。本次實(shí)驗(yàn)旨在探討丹蛭降糖膠囊對(duì)糖尿病大鼠腎臟NF-κB表達(dá)的影響及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取健康雄性大鼠55只，體質(zhì)量(190±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證：SCXK(皖)2012~2013。動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，自由飲食，室內(nèi)通風(fēng)良好，溫度保持在18～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2藥物與試劑吡咯列酮(杭州中美華東制藥有限公司產(chǎn)，15 mg/片,批號(hào):Hz0050500)；丹蛭降糖膠囊(DJC)(0.4g/粒，由太子參、地黃、牡丹皮、澤瀉、水蛭等組成，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑中心生產(chǎn)，批號(hào):20060601)；鏈尿佐菌素(STZ,美國Sigma公司，批號(hào)：S0130)；通用型二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：131208K)。

1.3主要儀器與設(shè)備血糖監(jiān)測儀(美國強(qiáng)生公司產(chǎn)),JD801形態(tài)分析系統(tǒng)(購自江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

1.4動(dòng)物分組模型建立及干預(yù)55只健康雄性大鼠用基礎(chǔ)飼料(蛋白質(zhì)16%，碳水化合物50%，脂肪8%，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按數(shù)字表法隨機(jī)抽取 9只作為健康對(duì)照組，余為實(shí)驗(yàn)組。健康對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；實(shí)驗(yàn)組予以高脂飼料喂養(yǎng)(蛋白質(zhì)14%，脂肪25%，碳水化合物51%，膽固醇5%，豬油10%)，4周后進(jìn)行造模，禁食8 h 后，將STZ用0.1M的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.4)配成2%濃度，按35 mg/kg的劑量給大鼠左下腹單次注射，誘發(fā)糖尿病模型，120 h后取尾靜脈測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。剔除造模未成功的大鼠5只，將造模成功后的41只的大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分成模型組11只，丹蛭低劑量組10 只，丹蛭高劑量組10只，吡格列酮組10 只，按人與大鼠單位體質(zhì)量折算系數(shù)計(jì)算出藥物組給藥量，丹蛭高、低劑量組分別按1.08 g·kg-1·d-1、0.54 g·kg-1·d-1灌胃，吡格列酮組按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康對(duì)照組和模型組按5 mL·kg-1·d-1給予0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)8周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，期間因血糖過高死亡2只，皮膚感染死亡2只。

1.5指標(biāo)檢測與方法連續(xù)治療8周，禁食8 h，以3%水合氯醛按10 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速分離雙腎，將新鮮組織置于凍存管中放于液氮中保存，嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行操作。并于造模后、治療后2周、4周和8周測定鼠尾隨機(jī)末梢血糖。選用JD801形態(tài)分析系統(tǒng)，對(duì)所選取視野中免疫組織化學(xué)陽性信號(hào)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算每個(gè)視野中NF-κB的陽性指數(shù)。免疫組織化學(xué)每張切片高倍鏡下(×400)依次觀察腎小球、腎間質(zhì)區(qū)域不重疊視野，并分析NF-κB與血糖相關(guān)關(guān)系圖。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腎組織NF-κB表達(dá)的變化光鏡觀察顯示：NF-κB在健康對(duì)照組腎組織中基本不表達(dá)或呈弱陽性表達(dá)；模型組的NF-κB在腎組織中表達(dá)明顯升高，特別在腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞中最為明顯，呈強(qiáng)陽性；與模型組比較，丹蛭高、低劑量組腎組織NF-κB表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，吡格列酮組腎組織中NF-κB的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。丹蛭高、低劑量組中NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)治療后明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，療效優(yōu)于吡格列酮組，見圖1，表1。

2.2對(duì)大鼠隨機(jī)血糖的影響造模后，模型組，丹蛭高、低劑量組，吡格列酮組血糖較正常組明顯升高(P<0.01)，治療2周后，丹蛭高、低劑量組血糖明顯降低(P<0.01)，丹蛭高劑量組療效優(yōu)于吡格列酮組。治療4~8周后，血糖下降平穩(wěn)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3對(duì)NF-κB與血糖的相關(guān)性分析高血糖與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.897,P<0.01。

3討論

結(jié)合大量古今文獻(xiàn)調(diào)查，在既往中醫(yī)證候?qū)W調(diào)查的基礎(chǔ)上，我們得出氣虛陰虧血瘀為糖尿病腎病基本病機(jī)，并以此為理論依據(jù)，參照中醫(yī)文獻(xiàn)中藥藥理部分研究最新成果，選擇具有益氣養(yǎng)陰活血功效的丹蛭降糖膠囊，觀察了對(duì)腎臟NF-κB的影響。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠腎組織中NF-κB活性明顯升高。予丹蛭降糖膠囊灌胃8周后，腎組織中NF-κB表達(dá)明顯減弱且優(yōu)于吡格列酮組，提示丹蛭降糖膠囊可抑制糖尿病大鼠腎NF-κB的過高表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。本研究結(jié)果還顯示丹蛭降糖方有很好的降糖效果(P<0.01)，其療效與吡格列酮組近似。通過對(duì)糖尿病模型大鼠NF-κB與血糖相關(guān)性分析提示：NF-κB的表達(dá)與大鼠血糖呈正相關(guān)，表明NF-κB與血糖關(guān)系密切。目前，已證實(shí)高血糖和氧化應(yīng)激的主要靶點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，并通過其調(diào)控與炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等密切相關(guān)的多種基因的表達(dá)，更多的研究正逐步向人們揭示糖尿病與炎癥和各種炎性因子之間存在必然的聯(lián)系[6-7]。

本方由太子參、地黃、牡丹皮、澤瀉、水蛭等組成，既符合氣虛陰虧血瘀的中醫(yī)病機(jī)，又符合糖尿病腎病現(xiàn)代藥理研究基礎(chǔ)[8]。方中水蛭是一味傳統(tǒng)活血中藥，對(duì)炎癥的早期及后期病理改變均有抑制作用，對(duì)急慢性炎癥有一定的控制作用，具有類炎性介質(zhì)拮抗作用，可高效清除循環(huán)免疫復(fù)合物，調(diào)節(jié)機(jī)

表1　各組糖尿病模型大鼠NF-κB陽性面積、平均灰度、陽性指數(shù)的比較±s)

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

表2　對(duì)大鼠不同時(shí)間段血糖的影響±s)

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01體免疫功能[9]；太子參具有益氣健脾、生津潤肺作用，能改善糖尿病大鼠的一般狀況，降低空腹血糖，降低三酰甘油和總膽固醇水平，但不影響胰島素水平[10]；牡丹皮具有清熱涼血，活血散瘀之功效，其主要活性成分為丹皮酚，蔣舜媛[11]的研究證明，牡丹皮具有解熱、抗炎、保肝、抗變態(tài)反應(yīng)的作用；生地黃可清熱涼血，養(yǎng)陰生津，地黃苷D可明顯提高血虛模型小鼠白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)和骨髓 DNA 含量及重量，還有降低糖尿病模型小鼠血糖的趨勢[12]。生地黃水煎劑對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性甲醛足腫脹有顯著的消腫作用[13]。

總之，本研究結(jié)果顯示丹蛭降糖方可抑制糖尿病大鼠腎組織NF-κB表達(dá)，其機(jī)制可能是通過多途徑干擾了炎癥狀態(tài)，對(duì)抗了炎性因子，抑制了NF-κB的高表達(dá)并降低血糖。

(本文圖1見插圖1-1)

參考文獻(xiàn)

[1]黃清河,郭漢城,姚春萌.來氟米特對(duì)糖尿病大鼠腎臟病理及NF-κB活化的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2010,11(2)：149-150.

[2]王水秀,馬云青.NF-κB在2型糖尿病中的發(fā)病機(jī)制[J].赤峰學(xué)院學(xué)報(bào),2012，28(1):49-51.

[3]夏麗娟,陳飛虎.核因子κB的分子生物學(xué)特性及其在炎癥反應(yīng)中的作用[J].安徽醫(yī)藥,2005,9(3):162-164.

[4]任莉榮,舒鈞.核因子κB的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011，17(6):814-816.

[5]王景福,邢恩鴻,段書眾，等.不同血糖控制水平糖尿病血液透析患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核因子κB的活性[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011，15(53):10011-10015.

[6]耿明霞.各期糖尿病腎病患者血糖、血脂及胰島素抵抗等指標(biāo)的變化及相關(guān)性分析[J].微循環(huán)學(xué)雜志,2011,21(2):53-56.

[7]王揚(yáng)天,王堅(jiān),馬馳原.核因子κB與糖尿病的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2007，20(3):310-314.

[8]方朝暉,程森華,吳倩.丹蛭降糖膠囊對(duì)早期糖尿病腎病患者血NF-κB和尿白蛋白排泄率的影響[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(5)：891-894.

[9]楊洪雁，杜智恒，白秀娟.水蛭藥理作用的研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,4(3)：128-133.

[10] 王文凱,賈靜,丁仁偉,等.太子參近年研究概況[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011，17(12):264-267.

[11] 蔣舜媛,李興平,白莜璐,等.丹皮的抗內(nèi)毒素和解熱作用研究[J].中藥藥理與臨床,2012，28(3):77-79.

[12] 劉朵,章丹丹,卞卡.地黃藥理藥化及配伍研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2012，23(3)：748-750.

[13] 王裕生.中藥藥理與應(yīng)用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1983：93-94.

《中國臨床保健雜志》官方微信正式開通

微信公眾平臺(tái)的開通，給雜志的讀者、作者、編者增加了一個(gè)互動(dòng)交流的渠道。雜志的優(yōu)秀論文、專題征稿活動(dòng)、出刊情況、會(huì)議通知等在雜志網(wǎng)站上發(fā)布的同時(shí)會(huì)在平臺(tái)上即時(shí)推送，便于大家對(duì)雜志情況有隨時(shí)隨地的了解。

關(guān)注我們：(1)打開微信，點(diǎn)擊下方“發(fā)現(xiàn)”，再點(diǎn)擊“掃一掃”，掃描本刊二維碼關(guān)注即可。(2)打開微信，點(diǎn)擊右上方“+”按鈕，點(diǎn)擊“添加朋友”，輸入本刊微信公眾平臺(tái)號(hào)碼，搜索后關(guān)注即可。

如果您喜歡我們的文章，請轉(zhuǎn)發(fā)至朋友圈，與您的朋友分享。

《中國臨床保健雜志》微信公眾平臺(tái)號(hào)碼：ZGLCBJZZ

《中國臨床保健雜志》微信公眾平臺(tái)二維碼：

The influence of danzhijiangtang capsule on the expression of NF-κB in renal tissue of diabetic rats

XIONGYuanyuan*，LIZhongnan，LIUShanshan，ZHANGFan,ZHANGPeipei

(*AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression level of NF-κ B in renal tissue of diabetic rodent model and the regulating action of Danzhijiangtang Capsule(DJC) .MethodsFifty-five male SD rats were randomly divided into 2 groups:control group and experimental group.The control group was fed with basal diet,the experimental group were fed with high fat diet.The animal model of diabetes mellitus were established by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ,35mg/kg).The experimental group were randomly divided into 4 groups:high-dose DJC,low-dose DJC ,pioglitazone and model.The group of high-dose DJC and low-dose DJC were treated with 1.08 g·kg-1·d-1,0.54 g/(kgod),pioglitazone group was treated with 10 mg·kg-1·d-1,the blank group and the model group were treated with physiological saline 5 mL·kg-1·d-1,each group were kept intragastric administration for 8 weeks.The NF-κB was test by Immunohistochemical.ResultsThe expression of NF-κB in model group increased significantly compared with the normal control group (P<0.01);the expression of NF-κB in high DJC group and low DJC group were significantly decreased compared with model group after 8 weeks(P<0.01).After 2 weeks ,the level of glucose was decreased significantly compared with model group(P<0.01) ,the blood glucose declined steadily after 4-8 weeks(P<0.01).ConclusionDanzhiJiangtang Capsule can reduce the level of blood glucose in type 2 diabetic rats and inhibit the expression of NF-κB in renal tissues.

[Key words]Diabetic Nephropathies；NF-kappa B；Hypoglycemic agents(TCD);Models,animal

(收稿日期：2014-09-05)

Corresponding author:LI Zhongnan，Email:LZN5151307@sohu.com

中圖分類號(hào)：R587.24

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.017

作者簡介：熊園園，碩士在讀，Email:2052910480@qq.com通信作者：李中南，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：LZN5151307@sohu.com

基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)立項(xiàng)課題(JDZX2012004)