陳美霓，郭巍，趙菊梅，魏曉麗

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，延安 716000 ；2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科)

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·基礎(chǔ)研究·

17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

陳美霓1，郭巍2，趙菊梅1，魏曉麗1

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，延安 716000 ；2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科)

[摘要]目的觀察17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素(17-AAG)對肝癌HepG2細(xì)胞增凋亡的影響,并探討其機(jī)制。方法采用吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)熒光染色，通過熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞凋亡情況；采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率的變化；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測17-AAG處理肝癌HepG2細(xì)胞前后bax和bcl-2的mRNA蛋白表達(dá)。結(jié)果AO/EB熒光染色結(jié)果顯示對照組呈均勻綠色熒光，實(shí)驗(yàn)組隨著藥物濃度的增加，呈紅色熒光凋亡細(xì)胞逐漸增多；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示17-AAG促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡；RT-PCR結(jié)果顯示17-AAG能使bax的mRNA蛋白表達(dá)水平升高、bcl-2的mRNA蛋白表達(dá)水平下降，其作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論17-AAG具有促進(jìn)肝癌HepG2凋亡作用，其機(jī)制可能與其上調(diào)bax、下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]肝腫瘤;Hep G2細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì);bcl-X蛋白質(zhì)

WHO癌癥研究中心(IARC)統(tǒng)計(jì)，2008年肝癌是全球第5位常見癌癥，其病死率占所有癌癥死亡率的第3位[1]。17-丙烯胺-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)是熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑，對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制生長、誘導(dǎo)凋亡的作用。本文通過體外實(shí)驗(yàn)探討17-AAG對HepG2細(xì)胞凋亡的作用，并通過檢測bax和bcl-2mRNA蛋白的變化對其作用機(jī)制做了初步研究。

1材料和方法

1.1材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞株HepG2由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室提供。(2)主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾公司)，17-AAG、氮唑藍(lán)、二甲亞砜及碘化丙啶(美國Sigma公司)，AnnexinV FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD pharmingen 公司)，Trizol(南京凱基生物技術(shù)有限公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，Bcl-2、Bax、β-actin引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(中國Fermentas 公司)。(3)主要儀器：熒光倒置顯微鏡及CCD(日本Nikon)，凝膠成像系統(tǒng)GENE(英國Syngene公司)，流式細(xì)胞儀FACS Calibur(美國Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞于RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，內(nèi)含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)健康對照組和實(shí)驗(yàn)組，血清濃度均為5%，實(shí)驗(yàn)組17-AAG濃度為0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L。

1.2.2吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙重?zé)晒馊旧^察細(xì)胞形態(tài)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以2×105/mL的密度接種于內(nèi)有干凈無菌蓋玻片的6孔板中24 h后，加入含藥培養(yǎng)基，并設(shè)對照組。培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌3次后滴濃度為100 μg/mL的 AO/EB混合液于爬片上30 s，夾出蓋玻片置于載玻片上，用波長為490 nm處的熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率將HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液以2×105/mL的密度接種6孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組作用48 h，胰酶消化離心收集細(xì)胞，按照AnnexinV FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒使用說明染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)收集實(shí)驗(yàn)組和對照組處理48h的HepG2細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA,取少量樣品用紫外分光光度儀在A260nm/A280nm處測定其濃度和純度，并合成cDNA，合成樣品于-80 ℃保存。取cDNA反應(yīng)原液2 μL，DEPC水39 μL，dNTP 1 μL，10×PCRbuffer 5 μL，上游、下游引物各1 μL，Taq聚合酶1 μL，總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性為94 ℃ 3 min，30個循環(huán)程序?yàn)?4 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃60 s，72 ℃延伸5 min。引物序列、大小及退火溫度見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，以β-actin 作為內(nèi)對照，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照及圖像分析。

表1　被檢測基因所使用的引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，各組間差異比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙重?zé)晒馊旧^察細(xì)胞形態(tài)17-AAG作用于HepG2細(xì)胞48 h后對活細(xì)胞進(jìn)行AO/EB雙染染色顯示，健康對照組細(xì)胞可見細(xì)胞核呈綠色熒光，細(xì)胞核形態(tài)完整，大小一致，著色均勻；實(shí)驗(yàn)組可見凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞核呈染色增強(qiáng)，均勻一致固縮狀或片段狀的紅色熒光，死亡細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，呈橘紅色熒光。隨著藥物濃度的增加，可見細(xì)胞數(shù)逐漸減少，凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞逐漸增多，見圖1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，HepG2細(xì)胞在17-AAG作用48 h后，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，與對照組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　17-AAG作用HepG2細(xì)胞48 h的凋亡率(n=4)

注：與對照組比較,aP<0.05

2.3RT-PCR檢測bax和bcl-2的mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，與健康對照組比較，17-AAG作用的HepG2細(xì)胞中bax mRNA表達(dá)隨著藥物濃度的增加而增加，bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸減少，bax和bcl-2的mRNA表達(dá)具有劑量相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)組不同濃度藥物對HepG2細(xì)胞bax和bcl-2 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3，圖2。實(shí)驗(yàn)組17-AAG濃度為0.63、1.25、2.5、5.0μmol/L的bcl-2/ bax比值分別為0.701、0.551、0.474、0.433，均低于健康對照組的比值1.366，呈一定的劑量關(guān)系。

表3　HepG2細(xì)胞的bax、bcl-2 mRNA表達(dá)水平

注：與對照組比較，aP<0.05

3討論

HSP90是眾多熱休克蛋白的一種，是細(xì)胞內(nèi)最活躍的分子伴侶蛋白之一，在應(yīng)激條件下維持細(xì)胞必需的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象保護(hù)細(xì)胞生命活動，它具有特殊的分子伴侶功能[2-3]。HSP90在眾多腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，并隨著腫瘤侵襲逐漸加深，HSP90的表達(dá)也逐步增加[4]。而腫瘤細(xì)胞中的HSP90過表達(dá)、蓄積，幾乎控制了所有惡性細(xì)胞表型組成成分及細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路[5]。HSP90還參與腫瘤血管的生長侵襲及轉(zhuǎn)移，在藥物耐受﹑增加腫瘤細(xì)胞輻射敏感性及抗凋亡信號通路活化等起重要作用[6-8]。Hsp90已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[9]。

17-AAG是HSP90特異抑制劑。研究證實(shí)17-AAG能與腫瘤來源的HSP90靶向結(jié)合，優(yōu)先殺死腫瘤細(xì)胞，同時通過阻斷多個信號通路的多個靶點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)凋亡，并且可以增加腫瘤對其他化療藥物的敏感性[10-11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AO/EB雙重?zé)晒馊旧拢?7-AAG處理的HepG2細(xì)胞可見體積小、核濃縮、強(qiáng)熒光的紅色凋亡小體，隨著藥物濃度的增加，凋亡小體也逐漸增多，并出現(xiàn)細(xì)胞核形態(tài)正常的橘紅色死亡細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞流式儀檢測結(jié)果證實(shí)，17-AAG有誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，隨著時間延長，凋亡作用明顯增強(qiáng)的作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是多基因嚴(yán)格控制的過程。其中bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，其中bax與bcl-2是一對互相拮抗的蛋白。bcl-2蛋白屬于線粒體蛋白，通過阻止線粒體里細(xì)胞色素C 釋放，抑制caspase蛋白酶的活化[12]；同時抑制Ca2+的跨膜流動，抑制PT孔的開放[13]，從而抑制細(xì)胞凋亡。bax蛋白通過二聚體形式改變線粒體膜的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本次試驗(yàn)RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的17-AAG作用HepG2細(xì)胞后，bax蛋白的表達(dá)隨著藥物濃度的上升而上調(diào)，而bcl-2蛋白則相反。有實(shí)驗(yàn)研究表明，Bax和bcl-2可以形成同源或異源bcl-2/bax二聚體，其比值增大時抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)比值減小時加速細(xì)胞凋亡[15]。本研究表明，17-AAG作用HepG2細(xì)胞后，可隨藥物濃度的增加而降低bcl-2/bax的比值，從而促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，HSP90抑制劑17-AAG能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能上調(diào)bax蛋白的表達(dá)、下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)，并同時下調(diào)bcl-2/bax比值有關(guān)。

(本文圖1,2見插圖1-1)

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Effects of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin(17-AAG) on apoptosis of human hepatoma carcinoma cell lines HepG2 in vivo

CHENMeini*,GUOWei,ZHAOJumei,WEIXiaoli

(*CenterofMedicalExperiment,Yan'anMedicalCollege,Yan'anUniversity,Yan'an716000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin(17-AAG) on cell apoptosis of Human hepatoma carcinoma cell Lines HepG2,and explore the possible mechanism.MethodsCellular morphological alterations were observed after AO/EB staining;the apoptosis and cell cycle of HepG2 cells were assayed by flow cytometry;the expression of apotosis related proteins bax and bcl-2 in HepG2 cells treated with 17-AAG were detected by RT-PCR．ResultsThe result of AO/EB double staining showed that the control homogeneously were green fluorescence;the experimental group were red fluorescent,and the red fluorescent was increased with drug concentration gradually;Flow cytometry result showed 17-AAG promote hepatocellular carcinoma HepG2 cell apoptosis;RT-PCR results showed that 17-AAG can increased bax mRNA expression levels of protein,decreased the BCL-2 mRNA protein expression levels,the effect was related with drug dose.Conclusion17-AAG can inhibit proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells,and the mechanism may be related to its effect in up-regulating bax protein expression and down-regulating the BCL-2 protein expression.

[Key words]Liver neoplasms;Hep G2 Cells;Apoptosis;bcl-2-Associated X Protein;bcl-X Protein

(收稿日期：2014-08-22)

Corresponding author:GUO Wei，Email:15756560@qq.com

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.016

通信作者：郭巍，主治醫(yī)師，Email：15756560@qq.com

作者簡介：陳美霓，實(shí)驗(yàn)師，Email：25677435@qq.com

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(12JK0713)；延安市科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013-KW15)； 2012年延安大學(xué)自然科學(xué)專項(xiàng)基金項(xiàng)目