張嬌珍,王小敏，潘秀芳

(1.海南海口市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科,570216；2.海南省第三人民醫(yī)院檢驗科)

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·論著·

流式細(xì)胞術(shù)在網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測中的應(yīng)用

張嬌珍1,王小敏1，潘秀芳2

(1.海南?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院檢驗科,570216；2.海南省第三人民醫(yī)院檢驗科)

[摘要]目的評價流式細(xì)胞儀測定外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞的性能。方法選取門診體檢及住院患者共300例，隨機選擇血標(biāo)本，采用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀進行網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)，分析其重復(fù)性，并與傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)染色顯微鏡法進行對比及做相關(guān)分析。結(jié)果流式細(xì)胞儀法與傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法關(guān)于網(wǎng)織紅細(xì)胞低值、中值及高值計數(shù)分別比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；流式細(xì)胞儀的變異系數(shù)4.3%，傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法8.2%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),兩種方法測定結(jié)果呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.994,P<0.01)。結(jié)論流式細(xì)胞儀計數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞快速，結(jié)果準(zhǔn)確，且重復(fù)性好，與傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)染色顯微鏡法高度符合。

[關(guān)鍵詞]流式細(xì)胞術(shù);網(wǎng)狀細(xì)胞;顯微鏡檢查

網(wǎng)織紅細(xì)胞(Ret)是介于晚幼紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞之間尚未完全成熟的紅細(xì)胞，是紅細(xì)胞成熟過程的一個重要階段，是反映骨髓造血功能的重要指標(biāo)[1]。檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞的相關(guān)參數(shù)對臨床上眾多疾病的診斷、治療和監(jiān)測有著重要的價值[2]。傳統(tǒng)的檢測方法為人工顯微鏡目測計數(shù)法，該方法操作費工、費時，受主觀因素影響較大，重復(fù)性差[3]。近年來，隨著熒光技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展及自動網(wǎng)織紅細(xì)胞分析技術(shù)的革新，網(wǎng)織紅細(xì)胞的測定自動化得到很大的發(fā)展。2014年3月至2014年7月我們采用BD公司FACSCalibur型流式細(xì)胞儀進行網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)，并與傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)染色顯微鏡法進行對比及相關(guān)分析，為今后臨床相關(guān)疾病的診斷和治療以及預(yù)后監(jiān)測提供有效的、準(zhǔn)確的及快捷的檢測手段。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來源選取我院2014年3月至2014年7月門診體檢及住院患者共300例，其中健康體檢者100例，單純性血小板減少50例(<50×109/L)，缺鐵性貧血50例，溶血性貧血50例，急性失血性性貧血60例，其他類貧血50例，采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管取靜脈血2 mL混勻，儲存，試驗時隨機選取上述標(biāo)本用于可比性分析。

1.2儀器與試劑日本OlympusBX-60型多功能光學(xué)顯微鏡，1%煌焦油藍(lán)試劑，按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版的要求配制[4],Miller窺盤，Beckman-Coulter XLMCL流式細(xì)胞儀為美國Beckman-Coulter產(chǎn)品及原裝配套試劑。

1.3方法

1.3.1傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[4]，用煌焦油藍(lán)染液對紅細(xì)胞進行活體染色，每份標(biāo)本由兩名熟練的、有經(jīng)驗的檢驗技師在油鏡下計數(shù)l 000個紅細(xì)胞，獲得網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，取平均值。

1.3.2流式細(xì)胞儀檢測法將標(biāo)本試管順序編號，制備陰性對照管。對照管中加入含0.1%NaN3的PBS緩沖液1 mL和5 μL全血。試驗管中加入Retic-COUNT試劑1 mL和5 μL全血，充分混勻。室溫暗處溫育30 min，4 h內(nèi)上機分析，分析前充分混勻上樣管。上流式細(xì)胞儀以Cellquest軟件獲取50 000個紅細(xì)胞，以低角度、高角度散射光對數(shù)點圖設(shè)紅細(xì)胞門，對照管調(diào)節(jié)電壓獲取陰性Marker，記錄并分析網(wǎng)織紅細(xì)胞平均熒光強度。試驗人員經(jīng)過廠家培訓(xùn)，嚴(yán)格按儀器操作規(guī)程做網(wǎng)織紅細(xì)胞分析，按照儀器操作規(guī)程，用配套校準(zhǔn)品作儀器校正，當(dāng)日用配套的全血質(zhì)控物(低、中、高)進行室內(nèi)質(zhì)控，各參數(shù)結(jié)果均在其靶值允許的范圍內(nèi)。

1.3.3重復(fù)性試驗取高、中、低值3份標(biāo)本，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀平行測試30次，同時進行煌焦油藍(lán)染色，每份推30張薄片油鏡下計數(shù)1000個紅細(xì)胞，分別計算出每份標(biāo)本網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV)。

1.3.4相關(guān)性試驗隨機取100份標(biāo)本，在用流式細(xì)胞儀法測定網(wǎng)織紅細(xì)胞的同時做傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)染色顯微鏡目測計數(shù)，每份標(biāo)本制作2張血片，由兩名有經(jīng)驗的檢驗師分別在油鏡下計數(shù)1000個紅細(xì)胞，取均值將兩者結(jié)果進行比較。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18.0軟件進行分析，兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗，符合正態(tài)分布計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1流式細(xì)胞儀測定與傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法測定相關(guān)性評價結(jié)果結(jié)果顯示，兩種方法測定結(jié)果呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.994,P<0.01)，直線回歸方程為Y=0.870X-0.211。

2.2兩種方法重復(fù)性試驗結(jié)果比較流式細(xì)胞儀法與傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法低值、中值及高值計數(shù)比較計數(shù)分別比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；流式細(xì)胞儀的變異系數(shù)4.3%，傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法8.2%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

3討論

紅細(xì)胞在骨髓中生成，需經(jīng)歷祖細(xì)胞、干細(xì)胞、原始紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，最后發(fā)育為成熟紅細(xì)胞，網(wǎng)織紅細(xì)胞是紅細(xì)胞成熟過程中的一個重要階段，是判斷骨髓紅系造血情況和療效觀察的重要指標(biāo)[5]。在不同階段的紅細(xì)胞的發(fā)展過程中，隨著紅細(xì)胞的成熟，其顏色變化會逐漸從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)楹懈嘌t蛋白成分的粉紅色細(xì)胞，而其所含的核糖核酸(RNA)成分也會相應(yīng)減少。網(wǎng)織紅細(xì)胞是有核紅細(xì)胞剛剛失去核的階段，仍屬未完全成熟的紅細(xì)胞，介于晚幼紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞之間的過渡段細(xì)胞，其胞質(zhì)中殘存的嗜堿性物質(zhì)RNA等源自有核紅細(xì)胞，這種嗜堿性物質(zhì)經(jīng)堿性染料活體染色后，形成藍(lán)色或紫色的點粒狀或絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)沉淀物，經(jīng)煌焦油藍(lán)活體染色后，在包體內(nèi)可見藍(lán)色點狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[6]，據(jù)此特性衍生出了多種檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞的方法?，F(xiàn)其檢測方法有傳統(tǒng)的顯微鏡目測法，又有儀器計數(shù)法，如網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)儀、血細(xì)胞分析儀及流式細(xì)胞儀等。傳統(tǒng)檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比是手工計數(shù)1000個經(jīng)煌焦油藍(lán)或新亞甲藍(lán)活體染色細(xì)胞，胞質(zhì)中可見核酸與堿性染料復(fù)合物，并計算其個數(shù)，存在諸多缺點，如手工染色方法由于操作環(huán)節(jié)多、人為影響因素大，其重復(fù)性和準(zhǔn)確性均有限[7]。我們結(jié)果顯示流式細(xì)胞儀法與傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法低值、中值及高值計數(shù)分別比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩種方法測定結(jié)果呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.994，P<0.01)，然而流式細(xì)胞儀的變異系數(shù)4.3%，傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法8.2%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，即流式細(xì)胞儀的變異系數(shù)明顯低于傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法法。

表1　流式細(xì)胞儀及傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法重復(fù)性試驗結(jié)果比較

流式細(xì)胞儀檢測法是一種對細(xì)胞進行自動分析的高技術(shù)、其特點是快速、準(zhǔn)確-每秒可測數(shù)千至上萬個細(xì)胞，短時間內(nèi)可以得到大量相關(guān)的信息，因此在存學(xué)科領(lǐng)域越來越受到人們的重視[8-9]。既往有研究證實流式細(xì)胞儀檢測法的精密度比手工法高，且可在數(shù)秒中檢測1000～1500 個/s以上的紅細(xì)胞，避免了因細(xì)胞計數(shù)不足而致結(jié)果偏差的影響，結(jié)果的準(zhǔn)確性也有所提高[10]；我們的觀察結(jié)果與此相近。另外，流式細(xì)胞儀檢測法不但可以計數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞，還可以測定網(wǎng)織紅細(xì)胞中殘留RNA的熒光強度值，對于骨髓移植、化療后造血功能恢復(fù)的監(jiān)測極其靈敏，是一種極早性提示指標(biāo)，可作為骨髓移植治療、化療的監(jiān)測指標(biāo)，尤其是對骨髓移植后的早期監(jiān)測具有重要意義[11]。

流式細(xì)胞儀檢測法在一定程度上也有其自身的局限性，其最大缺點是易受白細(xì)胞、JolIy小體、瘧原蟲和血小板的干擾，特別是白血病和白細(xì)胞增多的患者，其干擾主要表現(xiàn)在空白對照波峰拖尾、陽性區(qū)異常波峰[12]。因此，雖然流式細(xì)胞儀檢測法雖較傳統(tǒng)法有較大的改進，但仍不能偏廢傳統(tǒng)血片的檢查。傳統(tǒng)煌焦油藍(lán)顯微鏡法目前仍然是國內(nèi)外網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)的經(jīng)典方法，其操作簡便，試劑成本低廉，鏡下細(xì)胞形態(tài)直觀，因而仍然被廣泛應(yīng)用。我們要做的是在臨床工作中，做到兩者有機的結(jié)合，充分利用兩種方法的優(yōu)點，更好地為臨床服務(wù)。

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Application of flow cytometry for reticulocyte detection

ZHANGJiaozhen*,WANGXiaomin，PANXiufang

(*LaboratoryMedicineDepartment,HaikouTCMHospital,Haikou570216,China)

[Abstract]Objectives To evaluate the flow cytometric in reticulocyte detection of peripheral blood.MethodsA total of 300 cases of outpatient and hospitalizd patients were selected in our hospital from March 2014 to July 2014.Reticulocyte of random blood samples were detected by FACSCalibur flow cytometry.The repetition of FACSCalibur flow cytometry was analyzed and the correlation analyzed between FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy.ResultsThere were all no significant differences about the reticulocyte counting of low,median and high value between FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy respectively.The coefficient of variation of flow cytometry was 4.3% and that the traditional brilliant cresyl blue staining microscopy was 8.2%.There was significant difference between two methods (P<0.05).The correlation between the determination results of FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy was positive(r=0.994,P<0.01).ConclusionReticulocyte counting by Flow cytometric is fast,accurate,and good reproducibility.The results of reticulocyte counting by Flow cytometric are highly consistent with the traditional brilliant cresyl blue staining microscopy.

[Key words]Flow cytometry;Reticulocytes;Microscopy

(收稿日期：2014-10-20)

中圖分類號：R446.113

文獻標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.015

作者簡介：張嬌珍,主管檢驗師,Email:zjz0216@163.com