黃國付，汪伯毅，鄒璟，王華，張?zhí)品?/p>

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)是脊柱節(jié)段不穩(wěn)、骨贅形成、椎間盤突出等一系列脊柱退行性疾病的病理基礎[1]。針灸在腰椎間盤退行性疾病的保守治療中一直備受青睞，前期研究也證實了電針對腰椎間盤退行性疾病有良好的療效[2-3]，但其作用機制尚不十分明確。本研究擬構建腰椎間盤退變的動物模型，通過觀察夾脊電針對兔退變腰椎間盤組織中基質成分表達的影響，試圖探討夾脊電針防治腰椎間盤退變的可能機制，以期為臨床上應用電針防治腰椎間盤退變性疾病提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：選取40只骨骼發(fā)育成熟的健康雄性新西蘭大白兔，體質量為3.5～4.0kg，均由武漢大學實驗動物中心提供(合格證書編號4200593344)。在武漢市第一醫(yī)院中心實驗室適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。②實驗器材：軸向加壓造模器(湖北省十堰東風汽車有限公司設備制造廠)，電鉆(上海銳奇工具股份有限公司)，Signa HDx 3.0T磁共振器(美國通用電氣公司)，針灸針(中美合作泰成科技發(fā)展有限公司，規(guī)格：0.30×25mm)，HANS穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)，DYY-7C電泳儀電源，DYCZ-24DN垂直電泳槽，DYCZ-40電轉儀均由北京六一儀器廠提供；TS-1水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；③實驗試劑：丙烯酰胺(Amresco)，PMSF，RIPA裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒均由碧云天公司提供；顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物公司)，PVDF膜(Millipore)，GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司)，HRP標記羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法 ①造模：參照Kroeber等[4]的造模方法構建兔腰椎間盤退變的模型。先將實驗兔固定于俯臥位，耳緣靜脈給予5%的水合氯醛(2ml/kg)麻醉；麻醉后定位出實驗兔的L4和L5椎體棘突(兔髂棘約平L6椎體)；備皮后在椎旁同側予以記號筆標記，局部進行碘伏消毒；隨后在標記處切開約5mm的入口，逐層鈍性分離皮下筋膜及肌肉層形成開口；將直徑約1.5mm的克氏針經(jīng)該入口沿額狀面穿入，依次穿過皮膚、筋膜、肌肉層直達骨面，然后探尋椎體靠尾側部分厚實處的腹側緣作為椎體穿針點；用電鉆將克氏針沿額狀面橫穿椎體后，依次經(jīng)過對側肌肉層、皮下筋膜層后穿出皮膚；縫合開口處皮下筋膜和皮膚，最后在克氏針兩端連接椎間盤軸向施壓造模器，施以200N的壓力加壓28d(見圖1～3)。術后給予青霉素鈉40萬單位肌肉注射，每天1次，連續(xù)治療5d；通過磁共振器判斷造模是否成功。②分組：40只雄性新西蘭大白兔隨機分成4組：正常組、模型組、假模型組及電針組，每組各10只。正常組：自然飼養(yǎng)，不予任何處理；模型組：于兔L4、L5椎體間橫穿克氏針，并施以軸向加壓造模器加壓，不做治療；假模型組：同模型組，但不予椎體間加壓，不做治療；電針組：于造模成功后第1天開始進行電針治療，連續(xù)治療6d為一個療程，療程間間隔1d，總共治療4個療程。③治療：術后第28天時取下電針組實驗兔的造模器及克氏針后給予電針治療。操作者將實驗兔予以固定后對兔L4-5雙側夾脊穴(參照《實驗針灸學》中“實驗動物穴位標準定位”)施以針刺治療(采用無菌1寸針灸針[5]，針刺深度為0.5～0.8cm)，通過捻轉手法操作至針下有沉澀感，并將針柄上連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，刺激參數(shù)選擇調頻波2/15Hz，強度1～2mA；每天行1次針刺治療，持續(xù)20min。見圖4。

圖1穿克氏針圖2上造模器圖3椎體間加壓

圖4 電針治療

1.3 觀察指標 各組實驗兔在術后第28天時間點各取出5只，拆除加壓裝置，拔出克氏針，行L4-5椎間盤平掃，之后處死并取出腰椎間盤組織；之后正常組、假模型組另外5只維持原來操作，模型組另外5只繼續(xù)加壓28d，電針組另外5只去除加壓裝置及克氏針后予以電針治療28d；術后第56天各組另5只實驗兔再次行L4-5椎間盤平掃，之后處死并取出椎間盤組織；所有取出組織均通過Western blot檢測其中核心蛋白聚糖(decorin)的蛋白表達情況。首先根據(jù)蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳，然后根據(jù)預染marker顯示，充分分離目的蛋白，取出凝膠用蒸餾水沖洗，接著剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉緩沖液中。然后用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h。再加入一抗孵育，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗(1∶40000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，顯色曝光。用Band-Scan凝圖像分析軟件分析膠片中decorin平均吸光度值。

2 結果

2.1 磁共振檢測結果 達到28d造模周期后使用武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院Signa HDx 3.0T磁共振對實驗兔行MRI檢查，攝取T2加權(矢狀位)圖像，結果顯示：正常椎間盤各節(jié)段表現(xiàn)為均勻明亮的高信號，見圖5；在造模器加壓28d后，椎間盤出現(xiàn)了黑色低信號(箭頭指示處)，與上下相鄰節(jié)段椎間盤信號相比有明顯差別，與正常椎間盤相比也有明顯差異，見圖6。表明成功建立了椎間盤退變的動物模型。

圖5正常椎間盤圖6退變椎間盤

2.2 各組decorin表達結果 正常組、假模型組術后各時間點decorin蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義；模型組術后第28天、第56天及電針組術后第28天decorin含量與正常組及假模型組術后第28、56天相比明顯下降(均P<0.05)；模型組術后第56天較本組術后第28天decorin含量進一步下降(P<0.05)；電針組術后第56天decorin含量與本組術后第28天時及模型組術后第56d天明顯上升(均P<0.05)。見圖7，表1。

A.正常組 B.假模型組 C.模型組 D.電針組

圖74組干預后各時間點decorin的Western blot膠片顯影結果

表1 4組術后各時間點decorin平均灰度值比較

與正常組及假模型組術后第28天比較，aP<0.05；與模型組術后第28天比較，bP<0.05；與電針組術后第28天及與模型組術后第56天比較，cP<0.05

3 討論

椎間盤主要由纖維環(huán)、髓核和上下椎體軟骨終板三部分組成。三者結構上的特異性保證了椎間盤能夠維持脊柱的穩(wěn)定性，并且具有減震，合理分散脊柱軸向壓力的作用[6]。正常椎間盤屬于無血管組織，其營養(yǎng)供應主要依靠軟骨終板途徑，即椎體內血管的營養(yǎng)物質通過骨髓腔-血竇-軟骨終板界面擴散到椎間盤，營養(yǎng)髓核與纖維環(huán)內層[7]。隨著年齡的增長椎間盤不可避免的出現(xiàn)生理性退變，髓核細胞數(shù)目相應減少，其合成細胞外基質的質量降低。此時若外加異常應力長期作用于椎間盤，一方面會使得軟骨終板出現(xiàn)形變、損傷、硬化、鈣化等病理性改變，繼而影響到椎間盤的營養(yǎng)物質供應及代謝廢物的排除，從而導致椎間盤退變的發(fā)生[8]；另一方面，會使得椎間盤內相關炎癥因子增加，細胞外基質降解增強、合成減少，椎間盤張力下降，從而導致椎間盤退變[9]。Singh[10]指出，椎間盤退變主要表現(xiàn)為細胞外基質的變化，且隨著椎間盤退變的發(fā)生，細胞外基質中I型膠原、II型膠原、二聚糖、decorin等成分表達下調。decorin屬于蛋白多糖家族中的一種，亦稱為PGⅡ、PGS2及PG40。它是一種富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，通過核心蛋白與糖胺聚糖鏈相連[11]。由于其結構較為特殊，因而具有一定的抗纖維化和抗腫瘤作用，并廣泛應用于皮膚和腫瘤等領域[12]。然而decorin本質屬于蛋白多糖，也具有維持椎間盤的正常代謝及應力均勻分布的作用，故與椎間盤疾病也密切相關。研究者Risbud等[13]對Wistar大鼠椎間盤器官行整體培養(yǎng)，觀察髓核組織的變化，結果發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖、decorin內等基質成分在7d內均有不同程度下降，而7d后基本趨于穩(wěn)定。進一步證實了decorin與細胞外基質的關系。因此，若能通過某種手段改變髓核內蛋白多糖的含量，糾正基質降解與合成的失衡，或許能對延緩椎間盤退變起到一定的益處[14]。

本實驗參照參照國外研究者Kroeber等[4]的造模方法，在相鄰的椎體間進行短期動態(tài)加壓，通過刺激椎間盤基質降解與合成的失衡從而誘發(fā)椎間盤退變。實驗結果顯示：模型組術后第28d、第56d、電針組術后第28d decorin蛋白表達與正常組及假模型組術后第28d時相比均呈下降趨勢，可見軸向加壓作用于椎間盤可誘導腰椎間盤退變的發(fā)生，進而影響到細胞外基質的變化，導致decorin蛋白表達下調；模型組術后第56天decorin蛋白表達較本組術后第28天時進一步下降，可見在椎間盤退變的基礎上，隨著軸向加壓時間的延長，細胞外基質中的decorin會進一步降解；而電針治療28d(即電針組術后第56天)decorin蛋白表達較本組術后第28d及模型組術后第56天反而上調了，可見電針促進了細胞外基質中decorin成分的增加。本課題組前期研究結果證實[15-16]：電針可上調模型兔退變腰椎間盤組織中Bcl-2蛋白表達、下調Bax蛋白表達，使細胞凋亡的敏感性降低、抗凋亡能力增強，引起細胞凋亡減少，繼而影響椎間盤基質調節(jié)因子的表達，如上調合成代謝酶(骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)、抗分解代謝酶(基質金屬蛋白酶-1組織抑制因子)等的表達，下調分解代謝酶(基質金屬蛋白酶-13)的表達，從而糾正基質降解和合成代謝之間的失衡。基于此，我們認為電針可能通過提高椎間盤細胞外基質中decorin的含量，延緩了細胞外基質的降解，糾正了基質降解與合成之間的失衡，繼而起到了延緩腰椎間盤退變的作用。這一實驗結果揭示了電針治療腰椎間盤退變性疾病的可能機制，可以為臨床應用電針防治腰椎間盤退行性疾病提供一定的實驗依據(jù)，但這個過程具體通過哪種信號通路介導的仍需進一步深入研究。

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