任莎莎，李雪萍，林強(qiáng)，程凱，夏鵬，楊懷春，高明霞

研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞生物學(xué)改變與骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的發(fā)生具有一定相關(guān)性[1-2]，軟骨細(xì)胞凋亡與OA發(fā)病密切相關(guān)[3]。低強(qiáng)度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)在促進(jìn)骨折愈合方面有確切療效[4]，近幾年將其用于軟骨組織及其他軟組織方面的研究也越來越多[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)LIPUS能激活軟骨細(xì)胞及誘導(dǎo)Ⅱ型膠原(Type Ⅱ Collagen，COL2)mRNA表達(dá)來促進(jìn)COL2合成[7]；還可影響軟骨細(xì)胞膜表面應(yīng)力受體整合素表達(dá)，影響其下游局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、磷脂酰肌醇3(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)力化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成[8]。本研究主要應(yīng)用LIPUS作用于體外培養(yǎng)的兔膝軟骨細(xì)胞，分析LIPUS通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控兔膝OA軟骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動(dòng)物：健康的1月齡普通級(jí)新西蘭大白兔30只，由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)中心)提供，體質(zhì)量2.0～2.5Kg，雌雄不限，于24h晝/夜循環(huán)、無限量供應(yīng)水和食物的動(dòng)物設(shè)備中單籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。②主要器材及試劑：低強(qiáng)度脈沖超聲儀(osteoarthritis Ⅲ，日本株式會(huì)社)，胎牛血清(Giboco公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(南京凱基生物有限公司)，胰蛋白酶(南京凱基生物有限公司)，Ⅱ型膠原酶(Life Sciences公司)，PI3K/Akt抑制劑(美國(guó)Selleck公司)，COL2抗體(德國(guó)Acris公司)，基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrixmetalloproteinase-13，MMP-13)抗體、Akt抗體、磷酸化Akt抗體、Bcl-2抗體(武漢博士德公司)，P53抗體(美國(guó)LSBio公司)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(德國(guó)Millipore公司)，電泳儀與濕式電轉(zhuǎn)移槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法 ①造模：30只新西蘭大白兔隨機(jī)抽取24只進(jìn)行造模，采用前交叉韌帶切斷(anterior cruciate ligament transection，ACLT)法制作OA動(dòng)物模型[9]，統(tǒng)一選擇兔右后膝為手術(shù)關(guān)節(jié)。對(duì)照組僅切開關(guān)節(jié)囊。術(shù)后肌肉注射青霉素20萬U，每天2次，連續(xù)3d。制模3d后每日籠外放養(yǎng)1h，使其手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)主動(dòng)屈伸。②軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)：造模后第6周時(shí)處死實(shí)驗(yàn)兔，取膝股骨髁關(guān)節(jié)表面軟骨，分離軟骨細(xì)胞并培養(yǎng)，每天采用光學(xué)顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞貼壁情況，細(xì)胞鋪滿瓶底30%～40%時(shí)，換液去除培養(yǎng)基中死亡細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時(shí)傳代，傳至第2代于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行COL2免疫組化染色鑒定。③分組干預(yù)：假手術(shù)處理實(shí)驗(yàn)兔第2代軟骨細(xì)胞作為正常對(duì)照組(A組)，OA模型兔第2代軟骨細(xì)胞分為OA模型組(B組)、OA+LIPUS組(C組)、OA+LY294002(PI3K/Akt抑制劑)組(D組)、OA+LY294002+LIPUS組(E組)，每組各6只。超聲組細(xì)胞均給予LIPUS輻射，應(yīng)用HT2009-1型低強(qiáng)度脈沖超聲儀(日本，伊藤公司)，探頭置于培養(yǎng)瓶下方，探頭與培養(yǎng)瓶之間涂以耦合劑，耦合劑厚度不超過1mm，F(xiàn)REE模式，頻率為3MHz，輻射強(qiáng)度為40mW/cm2，通斷比為20%，每天輻射20min，每天1次，每周6d，持續(xù)1周。抑制劑組細(xì)胞給予PI3K/Akt抑制劑LY294002干預(yù)：將5mgLY294002干粉充分溶于325ul二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中，配制成50umol/L的LY294002溶液，于-20°C冰箱儲(chǔ)存，使用時(shí)將其按相應(yīng)的比例加入上述已配好的培養(yǎng)基中。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) ①軟骨組織HE染色及組織學(xué)評(píng)分：收集ACLT術(shù)側(cè)及假手術(shù)處理實(shí)驗(yàn)兔脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨，置入中性福爾馬林溶液中，準(zhǔn)備行病理學(xué)分析。并采用改良Mankin評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分[10]，包括纖維化、基質(zhì)分布、軟骨細(xì)胞缺失及軟骨細(xì)胞集落等方面，該評(píng)分分別在股骨內(nèi)髁、外髁，內(nèi)側(cè)和外側(cè)脛骨平臺(tái)進(jìn)行；最低4分，最高16分。由2位獨(dú)立的觀察者雙盲評(píng)價(jià)并出具相關(guān)報(bào)告。②軟骨細(xì)胞免疫組化染色鑒定：加片加蓋玻片后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。③western blot檢測(cè)：檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察及Mankin評(píng)分 正常關(guān)節(jié)軟骨表面規(guī)則，染色均勻，見圖1a；而OA關(guān)節(jié)軟骨明顯不規(guī)則，HE染色缺失，軟骨細(xì)胞明顯減少，見圖1b。與A組比較，B組Mankin總分增高(P<0.05)，同時(shí)B組纖維化、基質(zhì)分布及軟骨細(xì)胞集落評(píng)分較A組明顯增高(P<0.05)，但軟骨細(xì)胞缺失評(píng)分與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 正常軟骨細(xì)胞與OA軟骨細(xì)胞免疫組化結(jié)果 第二代正常軟骨細(xì)胞貼壁較快，主要呈星形、多邊形，圓形核仁居于細(xì)胞中央，可見1～3個(gè)較清晰的核仁，需7d左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶90%；第二代OA軟骨細(xì)胞較正常軟骨細(xì)胞貼壁慢，進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期慢，主要呈多邊形，其間夾雜不少樹突樣細(xì)胞，核仁肥大，增多，需12d左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶90%；見圖2a～b。免疫組化可見正常軟骨細(xì)胞COL2免疫組化染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒物質(zhì)，胞核基本無著色，見圖2c；OA軟骨細(xì)胞COL2免疫組化染色與正常軟骨細(xì)胞相比，其胞漿顆粒顏色較淺，見圖2d。

2.3 各組軟骨細(xì)胞COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2的Western表達(dá) 與A組比較，B組COL2、pAkt、Bcl-2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，MMP-13、P53蛋白表達(dá)均增高(P<0.05)，Akt蛋白表達(dá)無明顯差異，見圖3，4。與B組比較，C組COL2、pAkt、Bcl-2蛋白含量均增高，MMP-13、P53蛋白含量均下降(P<0.05)；D組COL2、Bcl-2蛋白、pAkt含量均下降，MMP-13、P53蛋白含量均升高(P<0.05)；E組COL2、MMP-13、P53、Bcl-2、pAkt蛋白含量無明顯變化，但與C、D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組Akt蛋白含量比較無明顯差異，見圖5，6。

a.A組 b.B組

圖1a～b A、B組軟骨組織HE染色

項(xiàng)目A組B組Mankin總分5．00±0．8210．00±1．26a纖維化1．33±0．472．83±1．17a基質(zhì)分布1．00±02．33±0．52a軟骨細(xì)胞缺失1．67±0．522．17±0．75軟骨細(xì)胞集落1．00±02．67±0．82a

與A組比較，aP<0.05

a.正常第二代軟骨細(xì)胞 b.OA第二代軟骨細(xì)胞

c.正常軟骨細(xì)胞COL2 d.OA軟骨細(xì)胞COL2

圖2a～d 正常與OA軟骨細(xì)胞鑒定

圖3A組與B組COL2、MMP-13、P53及Bcl-2的Western blot結(jié)果比較(與A組比較，*P<0.05)

圖4A組與B組Akt、pAkt的Western blot結(jié)果比較(與A組比較，*P<0.05)

圖5B組、C組、D組及E組COL2、MMP-13、P53及Bcl-2的Western blot結(jié)果(*P<0.05)

圖6B組、C組、D組及E組Akt、pAkt的Western blot結(jié)果(*P<0.05)

3 討論

軟骨細(xì)胞是成熟軟骨組織內(nèi)唯一的細(xì)胞類型，在軟骨損傷及重塑過程中起著重要作用，其增殖能力、細(xì)胞形態(tài)及分泌COL2的量可反映軟骨細(xì)胞的活性。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞有助于了解軟骨細(xì)胞增殖、分化及合成細(xì)胞外基質(zhì)過程中的影響因素，對(duì)研究OA病理等具有重要意義[11-12]。本研究通過體外培養(yǎng)正常、OA軟骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，第2代正常軟骨細(xì)胞主要呈星形、多邊形，生長(zhǎng)快，其COL2免疫組化染色呈陽(yáng)性；第2代OA軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)慢，主要呈多邊形，其間夾雜不少樹突樣細(xì)胞，其COL2免疫組化染色相對(duì)正常軟骨細(xì)胞，胞漿棕黃色顆粒變淺，提示OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)成功。

軟骨細(xì)胞外基質(zhì)由COL2、蛋白多糖等構(gòu)成，COL2約占基質(zhì)總量的80%-90%，由軟骨細(xì)胞分泌[13]。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的蛋白水解系統(tǒng)，其中MMP-13主要降解COL2[14-15]。正常關(guān)節(jié)軟骨中可發(fā)生細(xì)胞凋亡，是維持關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定等所必需的生理現(xiàn)象；研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞凋亡與基質(zhì)降解密切相關(guān)，OA軟骨細(xì)胞過度凋亡，可致基質(zhì)合成減少，逐漸形成惡性循環(huán)，是關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)展成骨性關(guān)節(jié)炎的重要原因[16]。

PI3K/Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為整合素下游信號(hào)通路之一，該通路是調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)重塑及抗軟骨細(xì)胞凋亡最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]。PI3K是一種膜蛋白，可接收膜上的酪氨酸激酶受體、細(xì)胞因子受體、CD19、BCR等傳入信號(hào)，從而直接或間接激活下游因子Akt，激活后的Akt主要通過對(duì)含有絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的底物(P53、NF-κB及Caspase-9等)磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[18]。研究表明PI3K/Akt通路與促凋亡因子P53及抗凋亡因子Bcl-2存在關(guān)聯(lián)性；正常和OA軟骨細(xì)胞內(nèi)均有P53表達(dá)，OA軟骨細(xì)胞表達(dá)更高，其下調(diào)可抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡[19]；P53基因還能誘導(dǎo)Bax基因表達(dá)，抑制Bcl-2基因表達(dá)，提示P53基因與Bcl-2基因家族在調(diào)控細(xì)胞方面也具有相關(guān)性[20]；Bcl-2 基因是Bcl-2家族成員之一，具有抑制細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命等功能，可部分抑制NO誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡[21]。

本研究結(jié)果顯示，A組與B組軟骨細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2蛋白；B組COL2、pAkt、Bcl-2蛋白表達(dá)量低于A組，而MMP-13、P53蛋白表達(dá)量高于A組，兩者Akt蛋白表達(dá)量無明顯差異。進(jìn)一步證明OA病理過程與軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中COL2和蛋白多糖基因表達(dá)，對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)有抑制作用，利于軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定[22]。LIPUS可增加增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，該作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[23]；還可激活退變?nèi)怂韬思?xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成[24]。LIPUS影響OA軟骨細(xì)胞凋亡的作用主要是通過機(jī)械效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，其機(jī)械效應(yīng)可對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生一種微應(yīng)力，使整合素蛋白在細(xì)胞膜發(fā)生聚集，當(dāng)逐漸聚集達(dá)到一定量時(shí)，細(xì)胞內(nèi)第一個(gè)信號(hào)分子局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK) 被磷酸化而激活，F(xiàn)AK的激活使PI3K的p85亞基發(fā)生磷酸化從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[25]。

本研究結(jié)果表明OA軟骨細(xì)胞予以LIPUS刺激后Akt磷酸化水平升高同時(shí)MMP-13、P53表達(dá)水平降低，Bcl-2、COL2表達(dá)水平增高；加入PI3K特異性抑制劑LY294002共培養(yǎng)后，Akt磷酸化水平降低的同時(shí)MMP-13、P53表達(dá)水平增高，pAkt、COL2、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，提示LIPUS照射能促進(jìn)Akt的磷酸化進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制炎癥因子MMP-13表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)COL2降解；抑制促凋亡基因P53蛋白表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)，對(duì)OA軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述， 本研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可經(jīng)PI3K/Akt通路上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因P53表達(dá)，降低兔膝OA軟骨細(xì)胞凋亡率，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，起到一定的保護(hù)軟骨的作用。但LIPUS對(duì)于晚期OA軟骨細(xì)胞及人軟骨細(xì)胞是否具有相同作用目前還無法證實(shí)，因此還需日后進(jìn)一步深入研究。

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