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        低強(qiáng)度脈沖超聲經(jīng)PI3K/Akt通路調(diào)控兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

        2015-03-14 01:27:39任莎莎李雪萍林強(qiáng)程凱夏鵬楊懷春高明霞
        中國(guó)康復(fù) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)磷酸化免疫組化

        任莎莎,李雪萍,林強(qiáng),程凱,夏鵬,楊懷春,高明霞

        研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞生物學(xué)改變與骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的發(fā)生具有一定相關(guān)性[1-2],軟骨細(xì)胞凋亡與OA發(fā)病密切相關(guān)[3]。低強(qiáng)度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)在促進(jìn)骨折愈合方面有確切療效[4],近幾年將其用于軟骨組織及其他軟組織方面的研究也越來越多[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)LIPUS能激活軟骨細(xì)胞及誘導(dǎo)Ⅱ型膠原(Type Ⅱ Collagen,COL2)mRNA表達(dá)來促進(jìn)COL2合成[7];還可影響軟骨細(xì)胞膜表面應(yīng)力受體整合素表達(dá),影響其下游局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,F(xiàn)AK)、磷脂酰肌醇3(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)力化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成[8]。本研究主要應(yīng)用LIPUS作用于體外培養(yǎng)的兔膝軟骨細(xì)胞,分析LIPUS通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控兔膝OA軟骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 ①動(dòng)物:健康的1月齡普通級(jí)新西蘭大白兔30只,由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)中心)提供,體質(zhì)量2.0~2.5Kg,雌雄不限,于24h晝/夜循環(huán)、無限量供應(yīng)水和食物的動(dòng)物設(shè)備中單籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。②主要器材及試劑:低強(qiáng)度脈沖超聲儀(osteoarthritis Ⅲ,日本株式會(huì)社),胎牛血清(Giboco公司),高糖DMEM培養(yǎng)基(南京凱基生物有限公司),胰蛋白酶(南京凱基生物有限公司),Ⅱ型膠原酶(Life Sciences公司),PI3K/Akt抑制劑(美國(guó)Selleck公司),COL2抗體(德國(guó)Acris公司),基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrixmetalloproteinase-13,MMP-13)抗體、Akt抗體、磷酸化Akt抗體、Bcl-2抗體(武漢博士德公司),P53抗體(美國(guó)LSBio公司),聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(德國(guó)Millipore公司),電泳儀與濕式電轉(zhuǎn)移槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。

        1.2 方法 ①造模:30只新西蘭大白兔隨機(jī)抽取24只進(jìn)行造模,采用前交叉韌帶切斷(anterior cruciate ligament transection,ACLT)法制作OA動(dòng)物模型[9],統(tǒng)一選擇兔右后膝為手術(shù)關(guān)節(jié)。對(duì)照組僅切開關(guān)節(jié)囊。術(shù)后肌肉注射青霉素20萬U,每天2次,連續(xù)3d。制模3d后每日籠外放養(yǎng)1h,使其手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)主動(dòng)屈伸。②軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng):造模后第6周時(shí)處死實(shí)驗(yàn)兔,取膝股骨髁關(guān)節(jié)表面軟骨,分離軟骨細(xì)胞并培養(yǎng),每天采用光學(xué)顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞貼壁情況,細(xì)胞鋪滿瓶底30%~40%時(shí),換液去除培養(yǎng)基中死亡細(xì)胞,細(xì)胞鋪滿瓶底80%~90%時(shí)傳代,傳至第2代于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并進(jìn)行COL2免疫組化染色鑒定。③分組干預(yù):假手術(shù)處理實(shí)驗(yàn)兔第2代軟骨細(xì)胞作為正常對(duì)照組(A組),OA模型兔第2代軟骨細(xì)胞分為OA模型組(B組)、OA+LIPUS組(C組)、OA+LY294002(PI3K/Akt抑制劑)組(D組)、OA+LY294002+LIPUS組(E組),每組各6只。超聲組細(xì)胞均給予LIPUS輻射,應(yīng)用HT2009-1型低強(qiáng)度脈沖超聲儀(日本,伊藤公司),探頭置于培養(yǎng)瓶下方,探頭與培養(yǎng)瓶之間涂以耦合劑,耦合劑厚度不超過1mm,F(xiàn)REE模式,頻率為3MHz,輻射強(qiáng)度為40mW/cm2,通斷比為20%,每天輻射20min,每天1次,每周6d,持續(xù)1周。抑制劑組細(xì)胞給予PI3K/Akt抑制劑LY294002干預(yù):將5mgLY294002干粉充分溶于325ul二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液中,配制成50umol/L的LY294002溶液,于-20°C冰箱儲(chǔ)存,使用時(shí)將其按相應(yīng)的比例加入上述已配好的培養(yǎng)基中。

        1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) ①軟骨組織HE染色及組織學(xué)評(píng)分:收集ACLT術(shù)側(cè)及假手術(shù)處理實(shí)驗(yàn)兔脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨,置入中性福爾馬林溶液中,準(zhǔn)備行病理學(xué)分析。并采用改良Mankin評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分[10],包括纖維化、基質(zhì)分布、軟骨細(xì)胞缺失及軟骨細(xì)胞集落等方面,該評(píng)分分別在股骨內(nèi)髁、外髁,內(nèi)側(cè)和外側(cè)脛骨平臺(tái)進(jìn)行;最低4分,最高16分。由2位獨(dú)立的觀察者雙盲評(píng)價(jià)并出具相關(guān)報(bào)告。②軟骨細(xì)胞免疫組化染色鑒定:加片加蓋玻片后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。③western blot檢測(cè):檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。

        2 結(jié)果

        2.1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察及Mankin評(píng)分 正常關(guān)節(jié)軟骨表面規(guī)則,染色均勻,見圖1a;而OA關(guān)節(jié)軟骨明顯不規(guī)則,HE染色缺失,軟骨細(xì)胞明顯減少,見圖1b。與A組比較,B組Mankin總分增高(P<0.05),同時(shí)B組纖維化、基質(zhì)分布及軟骨細(xì)胞集落評(píng)分較A組明顯增高(P<0.05),但軟骨細(xì)胞缺失評(píng)分與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

        2.2 正常軟骨細(xì)胞與OA軟骨細(xì)胞免疫組化結(jié)果 第二代正常軟骨細(xì)胞貼壁較快,主要呈星形、多邊形,圓形核仁居于細(xì)胞中央,可見1~3個(gè)較清晰的核仁,需7d左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶90%;第二代OA軟骨細(xì)胞較正常軟骨細(xì)胞貼壁慢,進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期慢,主要呈多邊形,其間夾雜不少樹突樣細(xì)胞,核仁肥大,增多,需12d左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶90%;見圖2a~b。免疫組化可見正常軟骨細(xì)胞COL2免疫組化染色呈陽(yáng)性,細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒物質(zhì),胞核基本無著色,見圖2c;OA軟骨細(xì)胞COL2免疫組化染色與正常軟骨細(xì)胞相比,其胞漿顆粒顏色較淺,見圖2d。

        2.3 各組軟骨細(xì)胞COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2的Western表達(dá) 與A組比較,B組COL2、pAkt、Bcl-2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),MMP-13、P53蛋白表達(dá)均增高(P<0.05),Akt蛋白表達(dá)無明顯差異,見圖3,4。與B組比較,C組COL2、pAkt、Bcl-2蛋白含量均增高,MMP-13、P53蛋白含量均下降(P<0.05);D組COL2、Bcl-2蛋白、pAkt含量均下降,MMP-13、P53蛋白含量均升高(P<0.05);E組COL2、MMP-13、P53、Bcl-2、pAkt蛋白含量無明顯變化,但與C、D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各組Akt蛋白含量比較無明顯差異,見圖5,6。

        a.A組 b.B組

        圖1a~b A、B組軟骨組織HE染色

        項(xiàng)目A組B組Mankin總分5.00±0.8210.00±1.26a纖維化1.33±0.472.83±1.17a基質(zhì)分布1.00±02.33±0.52a軟骨細(xì)胞缺失1.67±0.522.17±0.75軟骨細(xì)胞集落1.00±02.67±0.82a

        與A組比較,aP<0.05

        a.正常第二代軟骨細(xì)胞 b.OA第二代軟骨細(xì)胞

        c.正常軟骨細(xì)胞COL2 d.OA軟骨細(xì)胞COL2

        圖2a~d 正常與OA軟骨細(xì)胞鑒定

        圖3A組與B組COL2、MMP-13、P53及Bcl-2的Western blot結(jié)果比較(與A組比較,*P<0.05)

        圖4A組與B組Akt、pAkt的Western blot結(jié)果比較(與A組比較,*P<0.05)

        圖5B組、C組、D組及E組COL2、MMP-13、P53及Bcl-2的Western blot結(jié)果(*P<0.05)

        圖6B組、C組、D組及E組Akt、pAkt的Western blot結(jié)果(*P<0.05)

        3 討論

        軟骨細(xì)胞是成熟軟骨組織內(nèi)唯一的細(xì)胞類型,在軟骨損傷及重塑過程中起著重要作用,其增殖能力、細(xì)胞形態(tài)及分泌COL2的量可反映軟骨細(xì)胞的活性。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞有助于了解軟骨細(xì)胞增殖、分化及合成細(xì)胞外基質(zhì)過程中的影響因素,對(duì)研究OA病理等具有重要意義[11-12]。本研究通過體外培養(yǎng)正常、OA軟骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn),第2代正常軟骨細(xì)胞主要呈星形、多邊形,生長(zhǎng)快,其COL2免疫組化染色呈陽(yáng)性;第2代OA軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)慢,主要呈多邊形,其間夾雜不少樹突樣細(xì)胞,其COL2免疫組化染色相對(duì)正常軟骨細(xì)胞,胞漿棕黃色顆粒變淺,提示OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)成功。

        軟骨細(xì)胞外基質(zhì)由COL2、蛋白多糖等構(gòu)成,COL2約占基質(zhì)總量的80%-90%,由軟骨細(xì)胞分泌[13]。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的蛋白水解系統(tǒng),其中MMP-13主要降解COL2[14-15]。正常關(guān)節(jié)軟骨中可發(fā)生細(xì)胞凋亡,是維持關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定等所必需的生理現(xiàn)象;研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞凋亡與基質(zhì)降解密切相關(guān),OA軟骨細(xì)胞過度凋亡,可致基質(zhì)合成減少,逐漸形成惡性循環(huán),是關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)展成骨性關(guān)節(jié)炎的重要原因[16]。

        PI3K/Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,為整合素下游信號(hào)通路之一,該通路是調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)重塑及抗軟骨細(xì)胞凋亡最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]。PI3K是一種膜蛋白,可接收膜上的酪氨酸激酶受體、細(xì)胞因子受體、CD19、BCR等傳入信號(hào),從而直接或間接激活下游因子Akt,激活后的Akt主要通過對(duì)含有絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的底物(P53、NF-κB及Caspase-9等)磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[18]。研究表明PI3K/Akt通路與促凋亡因子P53及抗凋亡因子Bcl-2存在關(guān)聯(lián)性;正常和OA軟骨細(xì)胞內(nèi)均有P53表達(dá),OA軟骨細(xì)胞表達(dá)更高,其下調(diào)可抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡[19];P53基因還能誘導(dǎo)Bax基因表達(dá),抑制Bcl-2基因表達(dá),提示P53基因與Bcl-2基因家族在調(diào)控細(xì)胞方面也具有相關(guān)性[20];Bcl-2 基因是Bcl-2家族成員之一,具有抑制細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命等功能,可部分抑制NO誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡[21]。

        本研究結(jié)果顯示,A組與B組軟骨細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2蛋白;B組COL2、pAkt、Bcl-2蛋白表達(dá)量低于A組,而MMP-13、P53蛋白表達(dá)量高于A組,兩者Akt蛋白表達(dá)量無明顯差異。進(jìn)一步證明OA病理過程與軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

        近年來研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中COL2和蛋白多糖基因表達(dá),對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)有抑制作用,利于軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定[22]。LIPUS可增加增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達(dá),促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,該作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[23];還可激活退變?nèi)怂韬思?xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成[24]。LIPUS影響OA軟骨細(xì)胞凋亡的作用主要是通過機(jī)械效應(yīng)來實(shí)現(xiàn),其機(jī)械效應(yīng)可對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生一種微應(yīng)力,使整合素蛋白在細(xì)胞膜發(fā)生聚集,當(dāng)逐漸聚集達(dá)到一定量時(shí),細(xì)胞內(nèi)第一個(gè)信號(hào)分子局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase,F(xiàn)AK) 被磷酸化而激活,F(xiàn)AK的激活使PI3K的p85亞基發(fā)生磷酸化從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[25]。

        本研究結(jié)果表明OA軟骨細(xì)胞予以LIPUS刺激后Akt磷酸化水平升高同時(shí)MMP-13、P53表達(dá)水平降低,Bcl-2、COL2表達(dá)水平增高;加入PI3K特異性抑制劑LY294002共培養(yǎng)后,Akt磷酸化水平降低的同時(shí)MMP-13、P53表達(dá)水平增高,pAkt、COL2、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,提示LIPUS照射能促進(jìn)Akt的磷酸化進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制炎癥因子MMP-13表達(dá),從而減少細(xì)胞外基質(zhì)COL2降解;抑制促凋亡基因P53蛋白表達(dá),促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá),對(duì)OA軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。

        綜上所述, 本研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可經(jīng)PI3K/Akt通路上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá),下調(diào)促凋亡基因P53表達(dá),降低兔膝OA軟骨細(xì)胞凋亡率,調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成,從而促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變,起到一定的保護(hù)軟骨的作用。但LIPUS對(duì)于晚期OA軟骨細(xì)胞及人軟骨細(xì)胞是否具有相同作用目前還無法證實(shí),因此還需日后進(jìn)一步深入研究。

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        遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
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