張 莉，冷 俊，周 曄，張 蕾，楊惠萍，陳 峰

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院:1.檢驗(yàn)科;2.婦科;3.病理科 202150)

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·論 著·

液相基因芯片技術(shù)在崇明地區(qū)人乳頭瘤病毒檢測(cè)和分型中的應(yīng)用*

張 莉1，冷 俊1，周 曄1，張 蕾2，楊惠萍2，陳 峰3

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院:1.檢驗(yàn)科;2.婦科;3.病理科 202150)

目的 探究液相基因芯片技術(shù)在崇明地區(qū)人乳頭瘤病毒(HPV)檢測(cè)和分型中的應(yīng)用。方法 選取2011年5月至2013年4月該院婦科門診就診者宮頸脫落細(xì)胞500例，使用液相基因芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行HPV基因型檢測(cè)。并對(duì)80例患者進(jìn)行病理診斷，根據(jù)組織病理學(xué)將80例患者分為炎性反應(yīng)組、細(xì)胞學(xué)正常組、宮頸癌組、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ組、CINⅡ組、CINⅠ～Ⅱ組、CINⅢ組。將病理診斷結(jié)果和HPV DNA亞型分布結(jié)果結(jié)合分析，對(duì)崇明地區(qū)宮頸病變程度和HPV感染基因型的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果 500例標(biāo)本中共180例HPV陽(yáng)性患者，HPV總感染率為36%，共檢出22種基因型，按照感染率從高到低依次為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染為85.96%，低危型感染為14.04%。500例標(biāo)本中共180例HPV陽(yáng)性患者，其中44例(24.44%)患者年齡為21～25歲的女性，11例(6.15%)患者年齡為51～67歲的女性，隨著年齡的增大HPV陽(yáng)性例數(shù)減少。隨著宮頸病變級(jí)別的升高HPV感染率逐漸升高，兩兩比較結(jié)果顯示，炎性反應(yīng)組與正常組、CINⅢ組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅢ組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其余11對(duì)兩兩對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著宮頸病變級(jí)別的升高HPV多重感染率逐漸升高，但是僅炎性反應(yīng)組與CINⅢ、CINⅡ組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將組織病理學(xué)作為確診標(biāo)準(zhǔn)，液相芯片HPV DNA檢測(cè)CINⅢ、CINⅡ的特異度為76.63%，靈敏度為88.57%，陰性預(yù)測(cè)值為92.16%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為68.89%。結(jié)論 崇明地區(qū)常見(jiàn)的HPV感染基因型為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。HPV陽(yáng)性多發(fā)于年輕女性，且HPV多重感染和感染率均隨著宮頸病變的程度加重而加重。因而液相芯片HPV DNA檢查對(duì)大規(guī)模篩查和宮頸病變的臨床診斷有十分重要的價(jià)值。

液相基因芯片技術(shù)； 人乳頭瘤病毒； 檢測(cè)； 分型

人乳頭瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌的主要因素，具有較多的亞型，臨床上已經(jīng)明確其有40多種亞型感染在人下生殖道中，且根據(jù)亞型的致病能力將其分為低危型和高危型兩種類型[1]。臨床上常用來(lái)篩查宮頸癌的重要手段為HPV檢測(cè)，且基因芯片技術(shù)能夠與分型同時(shí)進(jìn)行，是用于HPV基因型研究的主要技術(shù)[2]。液相基因芯片技術(shù)是優(yōu)于固相芯片技術(shù)將Luminex XMAP作為基礎(chǔ)系統(tǒng)的新技術(shù)，采用96孔板操作，能夠1次將26種亞型全部呈現(xiàn)出來(lái)[3]。因此本文選取2011年5月至2013年4月本婦科門診就診者宮頸脫落細(xì)胞500例，使用液相基因芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行HPV基因型檢測(cè)。對(duì)液相基因芯片技術(shù)在崇明地區(qū)人乳頭瘤病毒檢測(cè)和分型中的應(yīng)用進(jìn)行了探究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年5月至2013年4月本院婦科門診就診者宮頸脫落細(xì)胞500例，年齡17～67歲，平均(33.6±8.4)歲。并將80例患者按照5歲1個(gè)年齡段分為8個(gè)年齡組。同時(shí)給予80例患者病理診斷，將其分為炎性反應(yīng)組(33例)、細(xì)胞學(xué)正常組(23例)、宮頸癌組(1例)、CINⅠ組(10例)、CINⅡ組(6例)、CINⅠ～Ⅱ組(1例)、CINⅢ組(6例)。

1.2 方法

1.2.1 材料 生物素標(biāo)志β-globin引物PCR、生物素標(biāo)志MY09-MY11通用物PCR、宮頸脫落細(xì)胞DNA抽提試劑盒、熒光標(biāo)志SA-PE、Luminex懸浮微球雜交探針，上述均為上海透景生命科技有限公司生產(chǎn)；Luminex 100多功能流式點(diǎn)陣分析儀(美國(guó)Luminex公司生產(chǎn))；Master Cycler Gradient PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn))。

1.2.2 采集標(biāo)本 根據(jù)宮頸脫落細(xì)胞取樣的要求和步驟采取宮頸細(xì)胞，并將標(biāo)本保存在有細(xì)胞保存液的小瓶中，放置在4 ℃的環(huán)境中保存等待檢測(cè)。

1.2.3 HPV分型檢測(cè) 提取宮頸脫落細(xì)胞HPV DNA，進(jìn)行HPV PCR擴(kuò)增，液體雜交，進(jìn)行Luminex 100 HPV分型，并將結(jié)果記錄下來(lái)。操作步驟和結(jié)果的判讀嚴(yán)格按照試劑盒的要求進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。各組間進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 崇明地區(qū)高危人群HPV基因型分布 研究結(jié)果顯示，500例標(biāo)本中共180例HPV陽(yáng)性患者，HPV總感染率為36%，共檢出22種基因型，按照感染率從高到低依次為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染為85.96%，低危型感染為14.04%。見(jiàn)表1。

2.2 不同年齡組HPV陽(yáng)性患者在所有HPV陽(yáng)性患者中的構(gòu)成比 研究結(jié)果顯示，500例標(biāo)本中共180例HPV陽(yáng)性患者，其中44例(24.44%)患者年齡為21～25歲的女性，11例(6.15%)患者年齡為51～67歲的女性，隨著年齡的增大HPV陽(yáng)性例數(shù)減少。見(jiàn)表2。

表1 崇明地區(qū)高危人群HPV基因型分布

注：?jiǎn)我恍透腥?0例，混合型感染76例，HPV各基因型陽(yáng)性共有256例。

表2 不同年齡組HPV陽(yáng)性患者在所有HPV陽(yáng)性

2.3 各病理組HPV單一型、多重感染陽(yáng)性率及總感染率 研究結(jié)果顯示，隨著宮頸病變級(jí)別的升高HPV感染率逐漸升高，兩兩比較結(jié)果顯示，炎性反應(yīng)組與正常組、CINⅢ組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅢ組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其余11對(duì)兩兩對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。隨著宮頸病變級(jí)別的升高HPV多重感染率逐漸升高，但是僅炎性反應(yīng)組與CINⅢ、CINⅡ組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將組織病理學(xué)作為確診標(biāo)準(zhǔn)，液相芯片HPV DNA檢測(cè)CINⅢ、CINⅡ的特異度為76.63%，靈敏度為88.57%，陰性預(yù)測(cè)值為92.16%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為68.89%。見(jiàn)表3。

表3 各病理組HPV單一型、多重感染陽(yáng)性率及總感染率

3 討 論

人乳頭瘤病毒是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小的DNA雙鏈病毒，有較強(qiáng)的宿主和組織特異性，強(qiáng)烈的噬上皮性，會(huì)導(dǎo)致人類的黏膜和皮膚增生異常，進(jìn)而引起多種惡性和良性的病變[4]。HPV病毒具有較長(zhǎng)的感染潛伏期，多見(jiàn)于亞臨床感染，因而需要對(duì)HPV感染進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷，預(yù)防癌變。液相基因芯片技術(shù)是一種將5.6 μm的聚苯乙烯微球作為熒光染料進(jìn)行染色的生物芯片，操作較方便，因而被廣泛應(yīng)用[5]。因此本文選取2011年5月至2013年4月本院婦科門診就診者宮頸脫落細(xì)胞500例，使用液相基因芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行HPV基因型檢測(cè)。對(duì)液相基因芯片技術(shù)在崇明地區(qū)人乳頭瘤病毒檢測(cè)和分型中的應(yīng)用進(jìn)行了探究。

本文研究結(jié)果顯示，500例標(biāo)本中共180例HPV陽(yáng)性患者，HPV總感染率為36%，共檢出22種基因型，按照感染率從高到低依次為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染為85.96%，低危型感染為14.04%。這與以往的研究結(jié)果不同，這說(shuō)明了HPV型特異性感染率會(huì)受到社會(huì)經(jīng)濟(jì)、人群、文化、地域等因素的影響[6]。500例標(biāo)本中共180例HPV陽(yáng)性患者，其中44例(24.44%)患者年齡為21～25歲的女性，11例(6.15%)患者年齡為51～67歲的女性，隨著年齡的增大HPV陽(yáng)性例數(shù)減少。隨著宮頸病變級(jí)別的升高HPV感染率逐漸升高，兩兩比較結(jié)果顯示，炎性反應(yīng)組與正常組、CINⅢ組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅡ組、宮頸癌組與CINⅢ組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其余11對(duì)兩兩對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。隨著宮頸病變級(jí)別的升高HPV多重感染率逐漸升高，但是僅炎性反應(yīng)組與CINⅢ、CINⅡ組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這可能是由于本文所采納的研究對(duì)象過(guò)少所致。將組織病理學(xué)作為確診標(biāo)準(zhǔn)，液相芯片HPV DNA檢測(cè)CINⅢ、CINⅡ的特異度為76.63%，靈敏度為88.57%，陰性預(yù)測(cè)值為92.16%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為68.89%。這說(shuō)明HPV感染的分型和早期診斷是處理宮頸病變的重要方法。而本文所使用的液相基因芯片技術(shù)具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：(1)較高的靈敏度：每一個(gè)微球上都能夠以共價(jià)鍵結(jié)合的方式將多個(gè)抗體、抗原和核酸包被，同時(shí)由于探針具有較高的密度，能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的信號(hào)，加上使用熒光檢測(cè)具有較高的敏感性，因而液相基因芯片技術(shù)具有較高的靈敏度[7]。(2)較高的通量：液相基因芯片技術(shù)能夠在同一時(shí)間對(duì)同一個(gè)標(biāo)本中多種不同的目的分子進(jìn)行定量和定性的分析，因而具有較高的通量[8]。(3)較快的反應(yīng)速度：由于液相基因芯片技術(shù)中的雜交過(guò)程是在懸浮的液相中進(jìn)行的，因而其所需要的反應(yīng)時(shí)間較短，同時(shí)雜交后可以直接讀數(shù)不需要進(jìn)行清洗，能夠節(jié)省大量的時(shí)間，具有較快的反應(yīng)速度[9]。(4)較高的靈活性：液相基因芯片技術(shù)能夠用于對(duì)各種核酸和蛋白質(zhì)的分析，并且可以根據(jù)不同的待測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行自由組合[10]。(5)操作簡(jiǎn)單。

綜上所述，崇明地區(qū)常見(jiàn)的HPV感染基因型為HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。HPV陽(yáng)性多發(fā)于年輕女性，且HPV多重感染和感染率均隨著宮頸病變的程度加重而加重。因而,液相芯片HPV DNA檢查對(duì)大規(guī)模篩查和宮頸病變的臨床診斷有十分重要的價(jià)值。

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Application of liquid gene chip technology in human papillomavirus detection and typing in Chongming area*

ZHANGLi1,LENGJun1,ZHOUYe1,ZHANGLei2,YANGHui-ping2,CHENFeng3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofGynecology;3.DepartmentofPathology,ChongmingBranchHospitalofXinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China)

Objective To explore the application of the liquid gene chip technology in the human papillomavirus (HPV) detection and genotyping in Chongming area.Methods 500 cases of cervical exfoliated cells in the gynecology outpatient department of our hospital from May 2011 to April 2013 were selected and performed the HPV genotyping by using the liquid gene chip technology.80 cases were performed the pathological diagnosis and divided into the groups of inflammation reaction,normal cytology,cervical cancer,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ,CINⅡ,CINⅠ-Ⅱand CINⅢ according to the histopathology.The pathological diagnosis results and subtype distribution results of HPV DNA were combined to conduct the analysis.The relationship between the degree of cervical lesions and HPV infection genotypes in Chongming area was analyzed.Results Among 500 specimens,180 cases were HPV-positive,the HPV total infection rate was 36%,22 genotypes were detected,according to the descending order which were in turn HPV-16,HPV-52,HPV-58,HPV-18,HPV-11,HPV-6 and HPV-31.Among them,the high risk infection accounted for 85.96% and low-risk infection for 14.04%.Among 500 cases of samples,180 cases were HPV-positive patients,including 44 patients(24.44%) aged 21-25 years old,11 cases(6.15%) patients aged 51-67 years old,with age increasing,number of HPV-positive cases was decreased.With the increase of cervical lesions severity,the HPV infection rate was increased,the pairwise comparison showed that the differences between the inflammatory group and the normal group,between CINⅢ and CINⅡ,between cancer group and CINⅡ group,between cervical cancer group and the CINⅢ group was not statistically significant (P>0.05);the differences of pairwise comparison in remaining 11 pairs had statistically significant difference(P<0.05).With the increase of cervical lesions,the multiple HPV infection rate was gradually increased,but only the differences between the inflammation group with the CINⅢ,CINⅡ groups were statistically significant(P<0.05).With the histopathology as the diagnostic standard,in testing CINⅢ and CINⅡ by the liquid chip HPV DNA, the specificity was 76.63%,the sensitivity was 88.57%,negative predictive value was 92.16% and the positive predictive value was 68.89%.Conclusion Common genotypes of HPV infection in Chongming area are HPV-16,HPV-52,HPV-58,HPV-18,HPV-11,HPV-6 and HPV-31.The HPV-positive is more common in young women,and the HPV multiple infection and infection rate are aggravated with the aggravation of cervical lesion severity.Thus the liquid chip HPV DNA examination has a very important value for large-scale screening and clinical diagnosis of cervical lesions.

liquid gene chip technology; human papillomavirus; testing; typing

上海市崇明縣科學(xué)技術(shù)發(fā)展資金資助項(xiàng)目(CK2011-28)。

張莉，女，本科，主任技師，主要從事臨床免疫學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.026

A

1672-9455(2015)17-2548-03

2015-02-19

2015-05-29)