吳艷花，陳英劍，胡志德，胡成進(jìn)

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實驗診斷科，濟(jì)南 250031)

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·論 著·

人激肽釋放酶相關(guān)肽酶5在卵巢癌中的表達(dá)及意義探討

吳艷花，陳英劍，胡志德，胡成進(jìn)△

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實驗診斷科，濟(jì)南 250031)

目的 檢測人激肽釋放酶相關(guān)肽酶5(KLK5)在卵巢癌患者血清中的水平，初步評估其作為腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價值。方法 應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗對40例卵巢癌血清和40例女性健康體檢血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，分析KLK5水平與臨床病理特征相關(guān)性，并對其臨床預(yù)測價值進(jìn)行分析。結(jié)果 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果提示，KLK5在卵巢癌患者血清中表達(dá)水平(3.77±1.47)ng/mL，顯著高于健康女性血清(0.86±0.45)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且KLK5表達(dá)水平與腫瘤臨床分期呈正相關(guān)，即臨床Ⅲ期KLK5水平(4.44±2.73)ng/mL顯著高于Ⅰ/Ⅱ期血清中KLK5水平(2.14±1.66)ng/mL；中低分化腫瘤血清中KLK5水平高于高分化組；KLK5在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組水平顯著高于無轉(zhuǎn)移組。結(jié)論 KLK5在卵巢癌血清中表達(dá)升高，且KLK5表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)，提示KLK5表達(dá)水平檢測可以用于腫瘤的診斷與預(yù)后判斷。

人激肽釋放酶相關(guān)肽酶5； 卵巢癌； 腫瘤標(biāo)記物

人組織激肽釋放酶基因家族屬于絲氨酸蛋白酶家族的一個亞群，是近年來發(fā)現(xiàn)的一類頗具潛力的腫瘤標(biāo)志物家族。該家族共包括15個成員，其編碼蛋白質(zhì)稱為人激肽釋放酶相關(guān)肽酶(KLKs)[1-2]。人激肽釋放酶相關(guān)肽酶5(KLK5)是KLKs家族成員之一，是由KLK5編碼而成的一種胰蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶，KLK5最早從皮膚中分離并被命名[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)KLK5廣泛存在于各種組織和生物體液中，在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等腫瘤中差異表達(dá)并與腫瘤的形成、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，是潛在的腫瘤標(biāo)志物[5-9]。臨床研究表明，血清KLK5表達(dá)與腫瘤臨床病理分期、癌癥復(fù)發(fā)及總生存率高度相關(guān)，對腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估以及療效監(jiān)測有重要意義。為進(jìn)一步確認(rèn)血清KLK5在卵巢癌中的應(yīng)用價值，本研究應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，定量檢測卵巢癌及健康女性血清中KLK5水平，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，探討KLK5在腫瘤診斷及預(yù)后中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011～2012年本院收治的卵巢癌住院患者血清40例，平均年齡(50.57±11.75)歲，所有病例均經(jīng)手術(shù)病理證實，在患者術(shù)前尚未進(jìn)行放、化療時收集血清。對照組為來自本院健康體檢中心的健康體檢者40例，平均年齡(42.04±13.63)歲。研究對象均清晨采取空腹靜脈血2 mL,以3 000 r/min離心5 min分離血清，-80 ℃保存待用。

1.2 儀器與試劑 ELISA檢測方法為本實驗室前期建立，酶標(biāo)多抗和鼠KLK5單抗均為本實驗室前期制備[10]；HRP-羊抗鼠、羊抗兔IgG均購自天根生物公司；96孔可拆酶標(biāo)板(Corning公司)；680酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 方法

1.3.1 包板 用包被緩沖液將KLK5單抗稀釋至7.5 μg/mL,每孔100 μL包被96孔板，4 ℃包被過夜。次日，將孔內(nèi)液體甩干后，用PBST洗板3遍，每次1 min；再用2%牛血清清蛋白(BSA)進(jìn)行封閉，37 ℃，1 h。

1.3.2 檢測 待測樣品或KLK5標(biāo)準(zhǔn)品恢復(fù)至室溫，以100 μL/孔加入96孔板中，37 ℃反應(yīng)45 min；洗板后操作同上，加入1∶1 000稀釋的酶標(biāo)多抗，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)40 min。所有標(biāo)本均做復(fù)孔檢測。

1.3.3 顯色 洗板后操作同上，加入TMB底物顯色劑A/B各50 μL，避光顯色10 min；每孔加入2 mol/L硫酸溶液50 μL終止顯色，以680酶聯(lián)免疫檢測儀讀取450 nm處OD值，觀察試驗結(jié)果。

1.3.4 結(jié)果分析 以健康女性血清平均KLK5水平x+2s為cut off值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)KLK5水平，將檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計描述分析，并與臨床病例資料進(jìn)行相關(guān)性分析。血清糖蛋白抗原125(CA125)水平為化學(xué)發(fā)光法檢測，參考范圍0～35 U/mL。

2 結(jié) 果

2.1 血清中KLK5表達(dá)情況 健康女性血清中KLK5水平平均0.86 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)差0.45，以x±2s為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，則陽性閾值為1.76 ng/mL；以此標(biāo)準(zhǔn)對40例卵巢癌血清進(jìn)行檢測，結(jié)果有27例為陽性則表明靈敏度為67.5%,40例健康女性血清中有37例陰性則特異度為92.5%。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，KLK5在卵巢癌患者血清中表達(dá)水平(3.77±1.47)ng/mL，高于健康婦女血清(0.86±0.45)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；卵巢癌臨床分期Ⅲ期KLK5表達(dá)水平(4.44±2.73)ng/mL，高于臨床分期Ⅰ/Ⅱ血清中KLK5水平(2.14±1.66)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。

2.2 KLK5在卵巢癌血清中的水平與臨床病理特征相關(guān)性分析 試驗結(jié)果顯示，KLK5在卵巢癌血清中表達(dá)情況與患者的年齡、腫瘤組織分型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與腫瘤的組織分化程度、腫瘤有無轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)；在中低分化卵巢癌血清中，KLK5水平明顯高于高分化腫瘤中KLK5水平；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者血清中KLK5蛋白水平明顯高于無轉(zhuǎn)移者，臨床Ⅲ期腫瘤血清中KLK5水平高于Ⅰ/Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 KLK5血清水平與臨床病例資料特征

2.3 KLK5與血清CA125聯(lián)合檢測 皮爾森相關(guān)系數(shù)分析顯示，血清KLK5水平與CA125無相關(guān)性，提示KLK5作為潛在的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物具有獨立的診斷價值。40例卵巢癌患者中血清CA125陽性(>35 U/mL)有23例，陽性率57.5%；40例卵巢癌患者中KLK5陽性(>1.76 ng/mL)有27例，陽性率67.5%；而血清KLK5或CA125陽性患者30例，陽性率為75.0%，提示將KLK5與CA125聯(lián)合檢測卵巢癌可提高卵巢癌診斷的陽性率。

3 討 論

在診治腫瘤的各種方法和手段中，腫瘤標(biāo)志物是腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療的關(guān)鍵。血清腫瘤標(biāo)志物因其檢測簡便、快速、安全無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)實惠等，而成為腫瘤診斷的常用方法。近年來，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的深入研究，一些潛在的新型腫瘤標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)。越來越多的報道提示，KLK5有可能成為最具潛力的新型腫瘤標(biāo)志物。

試驗中，應(yīng)用前期制備的純化多克隆抗體和單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，以單克隆抗體為捕獲抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)志的多克隆抗體為檢測抗體，以純化的KLK5重組蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。本研究檢測方法中所用抗體均經(jīng)蛋白A親和層析柱純化，且捕獲抗體為單克隆抗體，因此所建立的檢測方法具有較高特異性。

KLK5在多種腫瘤中存在差異表達(dá)，Shinoda等[11]研究表明KLK5在膀胱癌中的水平與疾病的侵襲類型有關(guān)。有研究報道，檢測KLK5在乳腺癌、胃癌、肺癌和子宮內(nèi)膜癌血清標(biāo)本中水平與健康人差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另有研究證實KLK5可以用于前列腺癌患者化療療效的預(yù)測[12]。在乳腺癌組織中KLK5水平明顯高于正常乳腺組織，KLK5高表達(dá)與乳腺癌患者的無病生存期和總生存期呈負(fù)相關(guān)[13]。關(guān)于KLK5在腫瘤中異常表達(dá)的機(jī)制目前尚無統(tǒng)一定論，但有研究證實與microRNA的靶向調(diào)節(jié)有關(guān)：microRNA可以與靶基因mRNA的3′-UTR結(jié)合，進(jìn)一步形成沉默復(fù)合體降解mRNA或者抑制其翻譯[14-15]。

試驗中由于標(biāo)本量有限，尚存在不足之處，有待于擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行深入研究，但是初步檢測結(jié)果提示KLK5作為潛在的腫瘤標(biāo)志物在卵巢癌中具有獨立的診斷及預(yù)后價值，為KLK5的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Study on expression and significance of kallikrein-related peptidases 5 in ovarian cancer

WUYan-hua,CHENYing-jian,HUZhi-de,HUCheng-jin△

(DepartmentofLaboratoryDiagnosis,GeneralHospitalofJinanMilitaryCommand,Jinan,Shandong250031China)

Objective To detect the serum kallikrein-related peptidases 5 (KLK5) level in ovarian cancer for evaluating its clinical application value as a tumor biomarker.Methods The double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was adopted to quantitatively examine serum KLK5 level in 40 cases of ovarian cancer and 40 female individuals undergoing physical examination.The correlation between the KLK5 level and clinicopathological features was analyzed and its clinical prediction value was analyzed.Results The clinical sample detection results prompted that serum KLK5 expression level in ovarian cancer was (3.77±1.47)ng/mL,which was significantly higher than (0.86±0.45)ng/mL in the healthy females,the difference was statistically significant (P<0.05);the KLK5 expression level was positively correlated with the tumor clinical classification,i.e.,the KLK5 level in clinical stage Ⅲ was significantly higher than that in the clinical stage Ⅰ/Ⅱ[(4.44±2.73)ng/mLvs.(2.14±1.66)ng/mL];serum KLK5 level in the middle and low differentiation tumor was higher than that in the high differentiation tumor;the serum KLK5 level in the lymph node metastasis group was significantly higher than that in the non-lymph node metastasis.Conclusion The serum KLK5 expression in ovarian cancer is increased,moreover the KLK5 expression is positively correlated with the clinical stage,which indicating that detecting the KLK5 level can be used in the diagnosis and prediction judgment.

kallikrein-related peptidases 5; ovarian cancer; tumor marker

吳艷花，女，碩士，初級檢驗師，主要從事分子診斷及腫瘤標(biāo)志物的研究?！?/p>

，E-mail:hcj6289@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.021

A

1672-9455(2015)17-2535-02

2015-02-13

2015-04-18)