林列坤，劉 青，趙志敏，吳祥林，張 松，楊菊紅

(廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 518106)

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·論 著·

嗜麥芽窄食單胞菌TopoⅡα耐藥途徑阻斷后的藥敏結(jié)果分析*

林列坤，劉 青，趙志敏，吳祥林，張 松，楊菊紅

(廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 518106)

目的 探討多重藥耐藥醫(yī)院獲得性嗜麥芽窄食單胞菌(SMA)耐藥途徑阻斷后的藥敏情況，為其臨床治療與合理用藥提供試驗(yàn)依據(jù)和思路。方法 選取2013年11月至2014年10月臨床分離的SMA 87株作為監(jiān)測(cè)對(duì)象，通過阻斷SMA耐藥性的TopoⅡα途徑，來觀察其對(duì)醫(yī)院獲得性SMA多重藥耐藥性的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移的抑制作用。結(jié)果 SMA菌株檢測(cè)在呼吸科檢出率最高，為25.29%，高于其他科室來源菌株檢出率；在痰液中檢出率最高，為35.63%，高于其他標(biāo)本類型菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前，87株SMA的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感率最高，為87.36%；對(duì)亞胺培南耐藥率最高，為100.00%，分別高于其他抗菌藥物的敏感率和耐藥率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑后，SMA對(duì)亞胺培南耐藥率最高，為83.91%；對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感率最高，為94.25%，與阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；氨曲南、頭孢吡肟、亞胺培南的敏感性較阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前增加，耐藥性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 通過阻斷SMA耐藥性的TopoⅡα途徑來沉默基因的表達(dá)，對(duì)醫(yī)院獲得性SMA耐藥性的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移有一定抑制作用，值得臨床推廣。

多重耐藥； 醫(yī)院獲得性； 嗜麥芽窄食單胞菌； 耐藥機(jī)制

嗜麥芽窄食單胞菌(SMA)作為院內(nèi)感染的重要病原菌之一，近年來明顯呈上升趨勢(shì)，且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，其根本原因與還未能完全闡明多重藥耐藥醫(yī)院獲得性SMA的耐藥機(jī)制有關(guān)[1]。因此，本研究通過阻斷SMA耐藥性的TopoⅡα途徑來沉默基因的表達(dá)，觀察能否有效抑制醫(yī)院獲得性SMA耐藥性的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年11月至2014年10月臨床各科室負(fù)責(zé)采集和送檢的SMA 87株作為監(jiān)測(cè)對(duì)象，采用MicroScan WalkAway-40全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)所有菌株進(jìn)行SMA鑒定。

1.2 方法及指標(biāo) 對(duì)87株耐藥性SMA進(jìn)行基因沉默轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的設(shè)計(jì)、合成，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的SmeDEF、SmeABC序列，β-內(nèi)酰胺酶即 Ll和L2酶序列和aac(6)2IZ序列，由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司利用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)合成10條siRNA序列；以shRNA的TopoⅡα質(zhì)粒為載體分別和上述10種siRNA序列相連，構(gòu)建10種質(zhì)粒，然后分別轉(zhuǎn)染SMA菌株[2]。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在細(xì)胞分子水平通過阻斷SMA耐藥性的TopoⅡα途徑來沉默基因的表達(dá)；觀察基因沉默前后，醫(yī)院獲得性SMA多重藥耐藥性的情況。

1.3 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用K-B試驗(yàn)法進(jìn)行，選擇藥敏紙片(英國(guó)Oxoid 公司生產(chǎn))，抗菌藥物種類根據(jù)本院臨床常用確定氨曲南、頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸、左氧氟沙星、米諾環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑等12種，選擇大腸埃希菌(ATCC 25922)和銅綠假單胞菌(ATCC 27853)為質(zhì)控菌株。試驗(yàn)結(jié)果判讀按2012年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) 推薦鑒定和檢測(cè)多重藥耐藥醫(yī)院獲得性SMA菌株的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[3]。

2 結(jié) 果

2.1 SMA的菌株檢測(cè)結(jié)果 SMA菌株檢測(cè)在呼吸科檢出率最高，為25.29%，高于其他科室來源菌株檢出率；在痰液中檢出率最高，為35.63%，高于其他標(biāo)本類型菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 SMA的菌株檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

注：與其他比較，*#P<0.05。

2.2 阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前87株SMA的藥敏檢測(cè)結(jié)果 阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前，87株SMA的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感率最高，為87.36%，對(duì)亞胺培南耐藥率最高，為100.00%，分別高于其他抗菌藥物的敏感率和耐藥率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑后SMA的藥敏檢測(cè)結(jié)果 阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑后，SMA對(duì)亞胺培南耐藥率最高，為83.91%；對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感率最高，為94.25%，與阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；氨曲南、頭孢吡肟、亞胺培南的敏感性較阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前增加，耐藥性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前SMA的藥敏

注：-表示無數(shù)據(jù)。

表3 阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑后SMA的

注：與阻斷前比較，*#P<0.05；-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

SMA可引起醫(yī)院獲得性肺炎、皮膚軟組織感染和尿道感染，嚴(yán)重者可引起導(dǎo)致心內(nèi)膜炎和菌血癥的發(fā)生[4]。且醫(yī)院獲得性SMA患者的多重耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重，并未隨著抗菌藥物的不斷更新而減輕[5]。如何特異性地阻斷醫(yī)院獲得性SMA耐藥途徑，有效抑制醫(yī)院獲得性SMA的生長(zhǎng)及增殖，亟待進(jìn)一步研究。

在醫(yī)院獲得性SMA多重藥耐藥的發(fā)生發(fā)展中，各種耐藥基因(轉(zhuǎn)換因子)可能起重要作用[6]：染色體遺傳基因介導(dǎo)的天然或突變產(chǎn)生的耐藥；質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性，所攜帶耐藥基因易于傳播；醫(yī)院中長(zhǎng)期大量使用抗菌藥物，對(duì)許多耐藥菌株的產(chǎn)生起促進(jìn)作用。

醫(yī)院獲得性SMA外膜具有低滲透性特點(diǎn)，對(duì)多種抗菌藥物天然耐藥[7]。該菌主動(dòng)外排系統(tǒng) SmeDEF可對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類、喹諾酮類、四環(huán)素等進(jìn)行外排，SmeABC的菌株表達(dá)則對(duì)β-內(nèi)酰胺酶、喹諾酮類和氨基糖苷類的耐藥性增強(qiáng)[8]。碳青霉烯類或頭孢菌素類抗菌藥物進(jìn)入人體內(nèi)后會(huì)迅速誘導(dǎo)SMA產(chǎn)生Ll和L2酶。L1型酶屬β-內(nèi)酰胺酶3型，表現(xiàn)為對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物高度耐藥；L2型酶屬β-內(nèi)酰胺酶2e型，能水解青霉素類和頭孢菌素類抗菌藥物，克拉維酸可抑制其活性[9]。SMA菌臨床株可有染色體上存在aac (6) 2IZ基因的氨基糖苷類等修飾酶，可使菌株對(duì)阿米卡星尤其妥布霉素耐藥。

自發(fā)現(xiàn)RNA干涉(RNAi)作用后，其一直受到關(guān)注，并發(fā)展成為對(duì)特定基因功能實(shí)施關(guān)閉的新技術(shù)[10]。近幾年RNAi研究領(lǐng)域發(fā)展迅速，目前RNAi已經(jīng)成為篩選新基因、探索基因功能和尋找有效藥物靶位的重要工具，利用短發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA的質(zhì)粒載體系統(tǒng) psilence4.1-拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(TopoⅡα)，篩選出對(duì)目的基因沉默效果最佳 的iRNA序列，從而對(duì)SMA耐藥性的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑后，SMA對(duì)亞胺培南耐藥率最高，為83.91%，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感率最高，為94.25%，與阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但對(duì)亞胺培南耐藥率有所下降，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感率有所上升；氨曲南、頭孢吡肟、亞胺培南的敏感性較阻斷SMA耐藥性TopoⅡα途徑前增加，耐藥性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示通過阻斷SMA耐藥性的TopoⅡα途徑來對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行沉默，對(duì)SMA耐藥性的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移有一定抑制作用。

綜上所述，通過阻斷SMA耐藥性的TopoⅡα途徑來沉默基因的表達(dá)，對(duì)醫(yī)院獲得性SMA耐藥性的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移有一定抑制作用，值得臨床推廣。

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Analysis on drug susceptibility results after blocking TopoⅡα drug resistance pathway in Stenotrophomonas maltophilia*

LINLie-kun,LIUQing,ZHAOZhi-min,WUXiang-lin,ZHANGSong,YANGJu-hong

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangmingNewDistrictPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518106,China)

Objective To investigate the drug susceptibility situation after blocking TopoⅡα drug resistance pathway in multi-drug resistant hospital-acquired Stenotrophomonas maltophilia (SMA) to provide the experimental evidence and thinking for its clinical treatment and rational drug use.Methods 87 clinically isolated strains of SMA in our hospital from November 2013 to October 2014 were selected as the monitoring objects.By blocking the Topo Ⅱα pathway of SMA drug-resistance,its inhibiting role on the SMA growth,proliferation and transferring was observed.Results The detection rate of SMA strain was highest(25.29%) in the respiration department,which was higher than the detection rate in the other departments;the highest detection rate was in sputum(35.63%),which was higher than that in the other types of specimen,the difference was statistically significant(P<0.05);before blocking the SMA drug-resistance Topo Ⅱα pathway,the drug susceptibility test results of 87 strains of SMA displayed that the sensitive rate to compound sulfamethoxazole was highest(87.36%) and the resistance rate to imipenem was highest (100.00%),which were higher than the sensitivity rate and resistance rate of other antibacterial drugs respectively,the differences were statistically significant(P<0.05);after blocking the SMA drug resistance Topo Ⅱα pathway,SMA had the highest resistance rate to imipenem(83.91%) and the highest sensitive rate(94.25%) to compound sulfamethoxazole,the differences had no statistical significance compared with before blocking (P>0.05);while the its sensitivity to aztreonam,cefepime and imipenem was increased comparing with before blocking the SMA drug resistance Topo Ⅱα pathway,and the drug resistance was dropped,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion Silencing gene expression by blocking the Topo Ⅱα pathway of SMA has certain inhibitory effect on the growth,proliferation and transferring of hospital acquired SMA,which is worthy of clinical promotion.

multidrug-resistant; hospital-acquired; Stenotrophomonas maltophilia; resistance mechanisms

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201303253)。

林列坤，女，本科，副主任技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.011

A

1672-9455(2015)17-2510-03

2015-03-15

2015-04-18)