張玥，張云山，薛鳳霞

在胚胎凍融技術(shù)出現(xiàn)之前，新鮮周期剩余胚胎只能丟棄，臨床醫(yī)生為了提高患者的妊娠率，一次最多移植5～8個胚胎，增加了多胎妊娠率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率及孕產(chǎn)婦并發(fā)癥的發(fā)生率。自1983年澳大利亞Trounson等專家進(jìn)行世界首例人類凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)臨床妊娠成功，1995年2月我國首例凍融胚胎試管嬰兒順利誕生，胚胎凍存技術(shù)快速發(fā)展，在預(yù)防卵巢過度刺激征(OHSS)、降低多胎率以及提高累積妊娠率、降低費(fèi)用等方面發(fā)揮了重要的作用。如何在保證臨床妊娠率、降低雙胎或多胎率的前提下，優(yōu)化凍存方案，盡可能地提高患者一次取卵的累積妊娠率，目前的技術(shù)還不成熟。本研究對1 182例行FET患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，以探討更有效、合理、經(jīng)濟(jì)的分配凍存胚胎的策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月—12月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心擬行FET的1 182個周期的患者臨床資料。1 182個解凍周期中有449個周期為玻璃化冷凍（A）組、733個周期為慢速程序冷凍（B）組；2組間年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）、不孕原因構(gòu)成比、不孕時間等一般情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。解凍后，A、B組分別有4例和12例患者因胚胎退化取消移植，使得A、B組的移植周期數(shù)分別為445和721。

Tab.1 Comparison of basic information between two groups of patients表1 2組患者的基本情況比較

1.2 凍存技術(shù)

1.2.1 玻璃化冷凍方法 采用日本KITAZATO公司的玻璃化冷凍、解凍試劑套盒，冷凍載體為cryotop。在室溫(24℃)下，將胚胎(最多3枚)移入平衡液中，胚胎首先皺縮，然后逐漸擴(kuò)張，最后基本恢復(fù)至原狀，預(yù)平衡約5～10 min；之后移入玻璃化冷凍液中，充分混合后迅速將胚胎置于cryotop的頂端，立即投入液氮中，時間控制在60 s之內(nèi)。玻璃化冷凍全過程需7 min。

1.2.2 慢速程序冷凍 （1）冷凍方法。Vitrolife公司提供的商品化即用型胚胎冷凍液包（FREEZE-KIT1 TM），按照說明書操作，最后將裝有胚胎的麥管置入已準(zhǔn)備好的程序冷凍儀（英國Planer公司，KRYO10 SeriesⅢ）中的麥管架上，開始冷凍。（2）冷凍程序。初始溫度24℃，以2℃/min速度降至-7℃，停留10 min；進(jìn)行手動植冰，停留5 min；以3℃/min速度由-7℃再降至-30℃；再以30℃/min速度從-30℃降至-80℃，停留5 min后直接投入液氮中貯存。冷凍過程需要2 h。

1.2.3 胚胎解凍后的觀察 胚胎存活的判定標(biāo)準(zhǔn)：胚胎卵裂球數(shù)50%以上完整并存活，顏色明亮均一，立體感較強(qiáng)。卵裂球存活的判定標(biāo)準(zhǔn)：具有完整清晰的細(xì)胞膜、胞質(zhì)均勻光澤、立體感強(qiáng)。

1.3 子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備 依照患者有無自發(fā)性排卵，選用適合的方案準(zhǔn)備內(nèi)膜。

1.3.1 自然周期內(nèi)膜準(zhǔn)備 平素月經(jīng)規(guī)律、有自發(fā)排卵患者，于月經(jīng)見血第11天開始用B超監(jiān)測卵泡生長至排卵，排卵日內(nèi)膜厚度＞7 mm，排卵后2 d行FET。

1.3.2 激素替代周期（HRT）內(nèi)膜準(zhǔn)備 平素月經(jīng)稀發(fā)、無自發(fā)排卵患者，于月經(jīng)見血第3天始口服戊酸雌二醇（依據(jù)內(nèi)膜厚度決定藥量，3～10 mg/d）17 d，后5 d同時加黃體酮支持，移植前1 d行B超監(jiān)測，若內(nèi)膜厚度＞7 mm，第2天行FET。

1.4 妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn)及隨訪 FET術(shù)后14 d測血人絨膜促性腺激素（HCG），如＞25 IU/L為生化妊娠，術(shù)后28 d行陰道B超檢查胎囊位置及個數(shù)，隨訪至分娩。計算著床率=妊娠胎囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠患者例數(shù)/移植周期數(shù)；流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)；異位妊娠率=異位妊娠例數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)；多胎率（包括雙胎及以上）=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)；早產(chǎn)率=早產(chǎn)周期數(shù)/分娩周期數(shù)。

1.5 分組 （1）按照移植胚胎數(shù)將445個玻璃化冷凍FET周期分為單胚胎移植組（E1組，28個周期），雙胚胎移植組（E2組，71個周期），三胚胎移植組（E3組，346個周期）。（2）按照移植優(yōu)胚數(shù)將445個玻璃化冷凍FET周期分組，有142個周期為0個優(yōu)胚移植（O0組），93個周期為1個優(yōu)胚移植（O1組），80個周期為2個優(yōu)胚移植（O2組），130個周期為3個優(yōu)胚移植（O3組）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種凍存方法對妊娠結(jié)局的影響 2組間子宮內(nèi)膜厚度、自然排卵/HRT周期構(gòu)成比、體外受精（IVF）/卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）構(gòu)成比、復(fù)蘇周期移植率差異無統(tǒng)計學(xué)意義；A組的復(fù)蘇胚胎成活率、無損傷胚胎復(fù)蘇率、移植胚胎數(shù)、著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率高于B組（P＜0.01），見表2、3。

2.2 玻璃化冷凍3組妊娠結(jié)局比較 與E2、E1組相比，E3組的臨床妊娠率、多胎率及活產(chǎn)率明顯提高（P＜0.01）；3組的著床率、流產(chǎn)率、異位妊娠率及早產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

Tab.2 Comparison of thawed embryo and endometrium information between two groups of patients表2 2組患者解凍胚胎及內(nèi)膜情況比較

Tab.3 Comparison of pregnancy outcome between two groups of patients表3 玻璃化冷凍組和慢速程序冷凍組患者妊娠結(jié)局比較（%）

Tab.4 The influence of number of embryos transferred in FET on pregnancy outcome表4 FET移植胚胎數(shù)目對妊娠結(jié)局的影響 （%）

2.3 玻璃化冷凍FET胚胎質(zhì)量對妊娠的影響 2組移植胚胎數(shù)、流產(chǎn)率、異位妊娠率及早產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。O2～3組的著床率、臨床妊娠率、多胎率、活產(chǎn)率高于O0～1組（P＜0.05），見表5。

Tab.5 The influence of number of optimal embryos transferred in FET on pregnancy outcome表5 FET移植優(yōu)胚數(shù)目對妊娠結(jié)局的影響

2.4 FET2個或3個優(yōu)胚妊娠結(jié)局的比較 O3組的著床率和多胎率高于O2組（P＜0.01），兩組間臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率及早產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表6。

Tab.6 The influence of transferring 2 or 3 optimal embryos in FET on pregnancy outcome表6 FET 2個或3個優(yōu)胚對妊娠結(jié)局的影響 （%）

3 討論

3.1 冷凍方法的選擇 凍融后胚胎質(zhì)量的決定因素主要有兩點(diǎn)：冷凍前胚胎的質(zhì)量和凍融技術(shù)[1]。在調(diào)整促排方案、改善胚胎培養(yǎng)環(huán)境提高胚胎質(zhì)量的基礎(chǔ)上，如何選擇凍融技術(shù)，增加患者一次取卵的累積妊娠率呢？玻璃化冷凍是近年來發(fā)展起來的冷凍新技術(shù)，其原理是采用高濃度的冷凍保護(hù)劑，在超快速的降溫過程中固化細(xì)胞內(nèi)外的水分，使細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，通過阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成減輕對細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的損傷[2]。

首先，玻璃化冷凍技術(shù)能夠去除細(xì)胞內(nèi)絕大部分水分，避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成而損傷胚胎。本研究對2012年在我中心行解凍移植的1 182個解凍周期病歷資料進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍復(fù)蘇后有83.3%的胚胎無損傷，著床率可達(dá)36.8%，臨床妊娠率可達(dá)57.1%，移植周期活產(chǎn)率高達(dá)47.9%，玻璃化冷凍組的復(fù)蘇胚胎成活率、無損傷胚胎率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率較慢速程序化冷凍組有顯著提高，且不增加多胎率、異位妊娠率和早產(chǎn)率，推薦使用玻璃化冷凍技術(shù)凍存胚胎。本研究中的cryotop是開放性載體，直接與液氮接觸，目前也有學(xué)者主張使用封閉性載體的趨向，以避免與液氮的接觸，增加玻璃化冷凍使用的安全性[2]。有研究數(shù)據(jù)顯示玻璃化冷凍囊胚和卵子解凍后的存活率也均高于慢速冷凍方法[3]。其次，玻璃化冷凍不需要程序化冷凍儀，簡便、快速，高效，僅需數(shù)分鐘即可完成，正逐漸應(yīng)用于各輔助生殖實(shí)驗室[2,4]。

3.2 胚胎冷凍方案的制定 如果患者新鮮周期移植后剩余6個及以上胚胎需要凍存，是凍2管，每管3個；還是凍3管，每管2個？如何合理制定胚胎凍存方案，既增加成功率又盡量降低雙胎率；也避免子宮容受性差的患者一次移植失敗浪費(fèi)過多胚胎，增加移植機(jī)會，增加一次取卵的累積妊娠率？在考慮患者子宮內(nèi)膜容受性的同時，主要依據(jù)胚胎質(zhì)量而定。

對于再次胚胎移植的患者，國家衛(wèi)計委最多允許移植3個胚胎，在不能保證患者100%的臨床妊娠率的前提下，勸說患者少移胚胎或單胚胎移植還存在巨大的困難。本研究對445個玻璃化冷凍周期按照移植胚胎數(shù)目分組后分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植3個胚胎較移植1或2個胚胎的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著升高，但多胎率也顯著性升高，增加減胎手術(shù)機(jī)會及妊娠期母嬰并發(fā)癥的風(fēng)險，移植3個胚胎已然成為了一把雙刃劍[5-7]；且將移植3個優(yōu)胚與移植2個優(yōu)胚相比較，臨床妊娠率及活產(chǎn)率無明顯升高，多胎率卻顯著增加，同時增加了多胎妊娠期母嬰并發(fā)癥的風(fēng)險。所以，臨床醫(yī)生應(yīng)盡力勸說患者一次FET最多移植2個優(yōu)胚，與移植3個優(yōu)胚相比較，不降低臨床妊娠率和活產(chǎn)率，卻可以有效地降低多胎率，此結(jié)論與張順吉等[8]研究結(jié)果相符。國外學(xué)者認(rèn)為整倍體單胚胎移植可提高IVF妊娠率，顯著降低流產(chǎn)率和多胎率，改善妊娠結(jié)局[9-10]，這也是筆者努力的方向。

綜上所述，玻璃化冷凍-復(fù)蘇后無損傷胚胎率可達(dá)83.3%，建議1管最多凍存2個優(yōu)胚，如胚胎質(zhì)量欠佳可1管凍存3個胚胎，而不要將3個優(yōu)質(zhì)胚胎凍存在1個麥管。對于有多胎妊娠流產(chǎn)史的年輕患者建議單優(yōu)胚或雙胚胎移植。另外，如遇患者內(nèi)膜容受性差且很難改善，若一次移植3個胚胎，如未著床就全部浪費(fèi)；可減少每管凍存胚胎數(shù)目，增加FET的次數(shù)，讓患者有更多移植機(jī)會，增加累積妊娠率。

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