蔣春潔等

摘要：利用鐮刀菌篩選模型和腫瘤細(xì)胞篩選模型對(duì) 190 株分離自海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis L.）的內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選。結(jié)果顯示，16 株內(nèi)生真菌的乙酸乙酯提取物對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、急性早幼粒白血病細(xì)胞NB4、人肝癌細(xì)胞HepG-2抑制率大于50%，具有細(xì)胞毒活性，其中菌株JFL3007a和BWL6045的乙酸乙酯提取物對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、急性早幼粒白血病細(xì)胞NB4、人肝癌細(xì)胞HepG-2均有較好的抑制作用。為進(jìn)一步尋找其生物活性成分奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海南粗榧；內(nèi)生真菌；鐮刀菌；抗腫瘤活性

中圖分類號(hào)： Q948.12+2.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0329-03

收稿日期：2014-04-04

基金項(xiàng)目：科技部中泰長期合作研究開發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：18-514J）；博士后科學(xué)基金 （編號(hào)：90279）；海南省自然科學(xué)基金 （編號(hào)：313034）。

作者簡(jiǎn)介：蔣春潔（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：903586099@qq.com。

通信作者：李從發(fā)，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：congfa@vip.163.com。海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis L.），為三尖杉科（Cephalotaxaceae）三尖杉屬（Cephalotaxus）植物，別名紅殼松、薄葉蓖子杉，屬多年生高大常綠喬木，為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。海南粗榧樹皮中含有5種在臨床上對(duì)急性非淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病等有顯著療效的酯堿：三尖杉?jí)A（cephalotaxine）、三尖杉酯堿（harringtonine，HT）、高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）、異三尖杉酯堿（isoharringtonine）、去氧三尖杉酯堿（deoxyharringtonine）[1]。海南粗榧中這5種生物堿的含量是三尖杉屬植物中含量最高的，被認(rèn)為是非常具有潛力的天然抗癌藥源[2]。

植物內(nèi)生菌（endophyte）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。因其長期生活在植物體細(xì)胞間隙這樣一個(gè)特殊環(huán)境中，并與寄主協(xié)同進(jìn)化，形成穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系，可能具備產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性成分的能力。1993年Strierle等首次從短葉紅豆杉（Taxus breviflia）的樹皮中分離出能產(chǎn)生具有抗腫瘤活性紫杉醇（Taxol）的內(nèi)生真菌，這為人類解決藥用植物生長緩慢，由于大量采伐引起資源緊缺和生態(tài)破壞等問題提供了新思路[3]。

近幾年來，從海南粗榧內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中分離到乙?；?xì)胞松弛素D、細(xì)胞松弛素D、環(huán)二肽、對(duì)羥基苯乙醇等抗腫瘤抗菌活性產(chǎn)物，以及一些新的化合物，初步揭示海南粗榧內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有多樣性[4-6]。我們從海南3處不同地點(diǎn)采集的海南粗榧樹皮、枝和葉樣品中，分離得到 190 株內(nèi)生真菌，利用鐮刀菌篩選模型和細(xì)胞模型對(duì)這些內(nèi)生真菌的抗腫瘤和抗菌活性進(jìn)行初步篩選，為進(jìn)一步研究其活性成分奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1內(nèi)生真菌190株海南粗榧內(nèi)生真菌，由本實(shí)驗(yàn)室從海南省熱帶植物園、海南省尖峰嶺自然保護(hù)區(qū)、海南省霸王嶺自然保護(hù)區(qū)的海南粗榧樹皮、樹枝、樹葉中分離，并保存。

1.1.2鐮刀菌模型菌株與腫瘤細(xì)胞株鐮刀菌（Fusarium oxysporum）C-4菌株，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供；人慢性髓原白血病細(xì)胞K562，急性早幼粒白血病細(xì)胞NB4購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，人肝癌細(xì)胞HepG-2購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.3培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （PDA）：200 g洗凈的土豆，切成小塊，加水煮至可以碾碎，分別用四層紗布，八層紗布和十六層紗布依次過濾，加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，定容至1 000 mL，pH自然。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：制作步驟同PDA培養(yǎng)基，不加瓊脂。 K562，NB4細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，HepG-2細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌發(fā)酵液樣品的制備將試管斜面保存的內(nèi)生真菌經(jīng) PDA 培養(yǎng)基活化后，接種于 PDB 培養(yǎng)基中，26 ℃、160 r/min 培養(yǎng)10 d。真空抽濾，取發(fā)酵液，5 000 r/min 離心 30 min 后取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2乙酸乙酯提取物樣品的制備將試管斜面保存的內(nèi)生真菌經(jīng) PDA 培養(yǎng)基活化后，接種于PDB 培養(yǎng)基中，26 ℃、160 r/min 培養(yǎng)10 d，分離菌體，50 ℃減壓濃縮至20～30 mL，用等體積乙酸乙酯萃取3次，再減壓蒸干。用含DMSO（1%）的PBS溶液溶解提取物，終濃度為2 000 μg/mL，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3鐮刀菌篩選模型[7]將鐮刀菌接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)10 d，用無菌水洗下孢子，搖勻過濾，用PDB培養(yǎng)基稀釋成濃度為1 mL 1×104個(gè)的孢子懸液。于96孔板上每孔加入50 μL孢子懸液，再加入50 μL發(fā)酵液樣品，并設(shè)置空白對(duì)照，4個(gè)復(fù)孔；繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，用倒置光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，對(duì)比空白對(duì)照，根據(jù)鐮刀菌孢子或菌絲生長的形態(tài)異常現(xiàn)象，對(duì)樣品的活性程度進(jìn)行等級(jí)劃分，分別表示為：生長抑制（×），高度變形（+++），中度變形（++），輕度變形（+），生長正常（—）。如圖1所示。

1.2.4最佳細(xì)胞鋪板濃度的確定[8-10]取對(duì)數(shù)生長期的人慢性髓原白血病細(xì)胞腫瘤細(xì)胞K562、急性早幼粒白血病細(xì)胞NB4（直接計(jì)數(shù)），人肝癌細(xì)胞HepG-2（用0.25%胰酶消化后，制成細(xì)胞懸浮液計(jì)數(shù)），接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔細(xì)胞密度從低到高依次為：1×104、2×104、4×104、6×104、8×104、 1×105個(gè)/mL，各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)72 h后，加 5 mg/mL 的MTT溶液20 μL，繼續(xù)反應(yīng)4 h，再加入100 μL三聯(lián)液，放置過夜，使甲臜完全溶解，在570 nm條件下，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量其D值。選擇D值與細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，且D值相對(duì)較大時(shí)的細(xì)胞濃度作為最佳細(xì)胞鋪板濃度。endprint

1.2.5腫瘤細(xì)胞篩選模型——MTT比色法[11]選取對(duì)數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮液，用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按各細(xì)胞的最佳鋪板濃度接種 90 μL 于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5% CO2，濕度 90%以上，37 ℃培養(yǎng)。24 h后加入樣品 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，取出置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，然后加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，37 ℃ 反應(yīng) 4 h 后，再向各孔加入 100 μL 三聯(lián)液（10%SDS，5%異丁醇，01%濃鹽酸），充分溶解，放置過夜。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔在570 nm的D值，按下式計(jì)算抑制率。

抑制率（IR）=（1-待測(cè)樣品D570值/空白對(duì)照D570值）×100%。

1.2.6活性菌株的形態(tài)鑒定將試管保藏的活性菌株接種于PDA平板上，待生長出菌絲后插片培養(yǎng)，將培養(yǎng)后帶有菌絲的插片用棉蘭染液染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、孢子的形態(tài)并拍照。根據(jù)真菌菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征，參照魏景超先生的《真菌鑒定手冊(cè)》第二版，初步判定其種屬。

2結(jié)果與分析

2.1最佳細(xì)胞鋪板濃度的確定

培養(yǎng)72 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定K562、NB4、HepG-2細(xì)胞數(shù)量與吸光度D值的關(guān)系（圖2）。選擇D值與細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，且D值在0.8～1.2之間的細(xì)胞濃度作為最佳細(xì)胞鋪板濃度，由圖2可知，K562、NB4、HepG-2細(xì)胞的最佳鋪板濃度分別為4×104、 6×104、 6×104個(gè)/mL。

2.2海南粗榧內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性

首先利用鐮刀菌篩選模型對(duì)海南粗榧內(nèi)生真菌的發(fā)酵液樣品進(jìn)行初篩，共獲得113個(gè)陽性樣品（活性程度至少為

“+”）。然后對(duì)挑選出的活性較好菌株發(fā)酵液用乙酸乙酯提取，利用MTT比色法進(jìn)一步檢測(cè)陽性樣品對(duì)K562等細(xì)胞的抑制率。發(fā)現(xiàn)至少對(duì)1株腫瘤細(xì)胞抑制率大于50%的陽性樣品有16個(gè)（表1）。其中，對(duì)K562細(xì)胞抑制率在90%以上的內(nèi)生真菌有9株，占內(nèi)生真菌總數(shù)的4.7%。菌株JFL3007a和BWL6045的乙酸乙酯提取物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，對(duì)K562、NB4和HepG-2細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到99.15%、88.41%、63.92%和88.30%、84.37%、69.35%。因此，JFL3007a和BWL6045可以作為潛力菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3活性菌株的形態(tài)鑒定

菌株JFL3007a和菌株BWL6045在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)10 d后其菌落形態(tài)見圖3。JFL3007a菌落蔓延生長，平坦，正面灰白色，背面黃褐色，菌絲不易挑起；BWL6045菌落蔓延生長，菌落高度約為2～3 mm，正面白色，有部分區(qū)域呈黃色，背面也為白色，菌絲呈棉絮狀，易挑起。

由兩株菌的顯微照片（圖4）顯示，兩者的菌絲與孢子形態(tài)均相似，菌絲有隔，未發(fā)現(xiàn)孢子囊，分生孢子單細(xì)胞，細(xì)小，呈橢圓形或卵形。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[12]初步判定其為半知菌亞門，腔孢綱，球殼孢目中的擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）。

3討論

稻瘟霉篩選模型是利用微管機(jī)能抑制活性原理篩選抗腫瘤藥物，因?qū)儆谡婧思?xì)胞，與人體細(xì)胞具有相似的生理基礎(chǔ)，其微管和微管蛋白結(jié)構(gòu)也相似，是近年來篩選抗腫瘤活性物質(zhì)的重要模型之一[13-14]。鮑時(shí)翔等[7]在篩選抗鐮刀菌抗生素時(shí)發(fā)現(xiàn)鐮刀菌Fusarium oxysporum T-6也可應(yīng)用于抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選，因此建立了鐮刀菌篩選模型，將該模型與腫瘤細(xì)胞篩選模型組合，成功篩選到了12株具有較好抗腫瘤活性的海洋微生物。考慮到鐮刀菌篩選模型具有實(shí)驗(yàn)周期短、樣品處理量大、所需費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，我們利用它對(duì)分離得到的190株海南粗榧內(nèi)生真菌進(jìn)行初篩，再用細(xì)胞模型復(fù)篩，篩選到16株具有抗腫瘤活性的內(nèi)生真菌。其中對(duì)3株腫瘤細(xì)胞均具有較好活性的菌株JFL3007a和BWL6045經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，均為擬莖點(diǎn)霉屬。擬莖點(diǎn)霉屬真菌是重要的植物病原菌，主要對(duì)被子植物和裸子植物有害，在熱帶、亞熱帶地區(qū)種類多[15]。擬莖點(diǎn)霉屬也是一種植物內(nèi)生真菌，在自然界的大部分植物體內(nèi)廣泛存在。勞佳萍[16]以各種藥用植物為研究對(duì)象，分離鑒定出擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌，并證實(shí)無論是病原擬莖點(diǎn)霉菌，還是共生擬莖點(diǎn)霉菌都不是寄主?；?。但目前對(duì)于植物內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中是否含有與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)，未見報(bào)道；在海南粗榧內(nèi)生真菌的研究方面，未見有發(fā)現(xiàn)擬莖點(diǎn)霉屬的報(bào)道。因此，對(duì)這兩株菌的分子生物學(xué)鑒定與代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]梅文莉，吳嬌，戴好富. 三尖杉屬植物化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2006，37（3）：452-458.

[2]傅立國. 三尖杉屬的研究[J]. 植物分類學(xué)報(bào)，1984，22（4）：277-288.

[3]黎萬奎，胡之璧. 內(nèi)生菌與天然藥物[J]. 中國天然藥物，2005，3（4）：193-199.

[4]Chen G，Dai H F，Sha Y，et al. Two new compounds from the endophytic fungus Colletotrichum sp. L10 of Cephalotaxus hainanensis[J]. Journal of Asian Natural Products Research，2011，13（11）：1042-1046.

[5]Dai W J，Dai H F，Wu J，et al. A new 5-acyl-2-methylpyrrole from the endophytic fungus S20 of Cephalotaxus hainanensis[J]. Natural Product Communications，2009，4（11）：1489-1490.endprint

[6]Dai W J，Wu J，Han Z，et al. Metabolites from endophytic fungus S20 of Cephalotaxus hainanensis[J]. Journal of Asian Natural Products Research，2009，11（8）：704-709.

[7]鮑時(shí)翔，林茂，黃惠琴，等. 利用組合篩選模型篩選海洋微生物抗腫瘤活性物質(zhì)[J]. 中國海洋藥物，2003（1）：17-20.

[8]侯春梅，李新穎，葉偉亮，等. MTT法和CCK-8法檢測(cè)懸浮細(xì)胞增殖的比較[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2009，33（4）：400，封3.

[9]李紅艷，夏啟勝，徐梅，等. MTT、MTS、WST-1在細(xì)胞增殖檢測(cè)中最佳實(shí)驗(yàn)條件的研究[J]. 中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（11）：824-826.

[10]李寧，萬文婷，金林紅. CCK-8法和MTT法檢測(cè)人前列腺癌PC3細(xì)胞活性的最佳條件比較研究[J]. 貴州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，26（3）：18-20.

[11]Mosmann T. Rapid colorinetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods，1983，65：55-63.

[12]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[13]Gunji S，Aritma K，Beppu T. Screening of antifungal antibiotics according to activities inducing morphological abnormalities[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1983，47：2061-2067.

[14]郭文，蔣繼志. 利用稻瘟霉模型初級(jí)篩選抗腫瘤物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)通報(bào)，2010，45（4）：1-3.

[15]李雪光，潘鳳娟，宋潔，等. 擬莖點(diǎn)霉屬及其病害研究進(jìn)展[J]. 大豆科技，2012（6）：32-37.

[16]勞佳萍. 植物內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉屬生物多樣性研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2007.孫勇，蔣繼宏，張海燕. 植物內(nèi)生木霉的鑒定及其抑菌活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：332-333.endprint