喬正榮，付志豪，馮虎翼，李元君，龔建平，李生偉

（重慶市第五人民醫(yī)院普外科 400062）

肝癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)切除一直是首要的治療手段。但由于肝癌的早期癥狀與體征不明確，致使大多患者在確診時(shí)就已錯(cuò)過最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)。單一的局部治療手段對晚期肝癌患者的治療效果不佳，所以，多種方法的綜合治療為中晚期肝癌的治療提供新的思路。射頻消融（RFA）、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（TACE）和高頻熱療（HFH）是目前常用的局部治療方式，而且他們之間的綜合治療的效果明顯優(yōu)于單一治療方式的治療效果[1-2]，但具體的機(jī)制尚不明確。因此，本研究建立兔VX2肝移植瘤模型，檢測三者之間聯(lián)合治療后癌組織中細(xì)胞凋亡和Caspase-3的表達(dá)情況，并初步探討聯(lián)合治療后對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)，新西蘭大白兔40只，體質(zhì)量1.5～2.0kg，購于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK（渝）2012-0001，雌雄不限，隔籠喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 TUNEL試劑盒（Roche公司），兔抗兔Caspase-3抗體（博士德公司），免疫組織化學(xué)試劑盒（中杉金橋公司），RT reagent Kit（Takara公司），RNA抽提試劑盒（Omega公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司），HCGF-3000型冷循環(huán)射頻治療儀及單極射頻針（和佳公司），HCGF-2000型體外高頻治療儀（和佳公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立、分組及治療方式 建立腫瘤模型全部成功。隨機(jī)分為RFA＋TACE治療組（A組）、RFA＋TACE＋HFH治療組（B組）、RFA＋HFH治療組（C組）和TACE＋HFH治療組（D組），每組10只。治療方式：C組：麻醉后開腹，在腫瘤中央插入單極射頻消融針，功率為10W，治療區(qū)域顏色發(fā)黑后停止治療。RFA治療后第1、4、7天分別給予HFH治療儀治療，治療頻率為13.56MHz，持續(xù)15min。B組：麻醉后開腹，暴露肝動(dòng)脈及其分支，暫時(shí)給予阻斷肝動(dòng)脈分支，用皮針直接在肝固有動(dòng)脈緩慢注入碘化油乳劑0.2 mL／kg，注完后開放肝動(dòng)脈，可在腫瘤表面觀察到乳白色碘油沉積。再行RFA治療。RFA治療后第1、4、7天分別給予HFH治療儀治療。A組：先行TACE治療，再行RFA治療。D組：先行TACE治療，治療后第1、4、7天分別給予HFH治療儀治療。于第7天處死全部實(shí)驗(yàn)兔，切取腫瘤中心組織、邊緣組織作為檢測標(biāo)本收集。

1.3.2 缺口末端核苷標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡及計(jì)算凋亡指數(shù) 取出各組標(biāo)本，具體步驟按TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下腫瘤細(xì)胞核顯示棕黃色顆粒為陽性，每組隨機(jī)取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）＝陽性細(xì)胞數(shù)／腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測各組腫瘤組織Caspase-3蛋白變化 取出各組標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)SP法。具體步驟按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。陽性標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為陽性。

1.3.4 Western blot檢測各組腫瘤組織中的Caspase-3蛋白含量 取出各組標(biāo)本，提取組織蛋白、制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、洗滌等過程，然后顯影，分析結(jié)果。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組Caspase-3mRNA的表達(dá)水平 將組織磨碎，提取無RNase的水溶解RNA，RNA定量。逆轉(zhuǎn)錄參照試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2min；隨后95℃10s，退火溫度15s，72℃延伸45s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。上游引物：5′-CAA TGG ACT CTG GGA AAT-3′，下游引物：5′-GCA AGC CTG AAT AAT GA-3′。采用△△CT法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對定量反應(yīng)，計(jì)算相對含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的情況 治療后各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，A組為（148.7±8.682）U／L、B組為（170.5±7.084）U／L、C組為（67.55±4.159）U／L、D組為（132.1±4.485）U／L。與其他組比較，B組治療后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 治療后各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化情況

2.2 在光學(xué)顯微鏡下TUNEL檢測殘余腫瘤的凋亡結(jié)果 在各組觀察的細(xì)胞凋亡，可見細(xì)胞核呈棕黃色顆粒的凋亡細(xì)胞，見圖2。各組細(xì)胞凋亡指數(shù)：A組為（17.09±1.310）%，B組為（25.11±1.998）%，C組為（9.684±1.020）%，D組為（5.780±0.583）%，B組凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖2 各組腫瘤組織細(xì)胞的凋亡變化（×400）

圖3 各組細(xì)胞凋亡指數(shù)情況

2.3 免疫組織化學(xué)檢測Caspase-3蛋白在各組表達(dá)情況 在顯微鏡下，Caspase-3蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)棕黃色顆粒。與其他組比較，B組腫瘤胞質(zhì)染色深，而且數(shù)量也多，見圖4。

2.4 Western blot檢測Caspase-3蛋白在各組表達(dá)情況 Caspase-3蛋白在各組的相對表達(dá)量：A組為0.860 3±0.048 71，B組為1.293±0.006 590，C組為0.549 5±0.037 40，D組為0.340 6±0.019 90，其中，B組表達(dá)最高，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Caspase-3mRNA水平 Caspase-3mRNA在各組的相對表達(dá)量：A組為4.242±0.181 4，B組為7.943±0.746 9，C組為1.744±0.145 4，D組為1.021±0.263 2。其中，B組表達(dá)最高，與其他組比較差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-3蛋白在各組表達(dá)情況（×400）

圖5 Caspase-3蛋白在各組腫瘤組織中的表達(dá)情況

圖6 Caspase-3mRNA在各組中的表達(dá)情況

3 討論

RFA、TACE、HFH是安全易行的局部治療方法，且應(yīng)用十分廣泛。局部治療已成為延長晚期肝癌患者生存的最為有效方法，但由于單一的治療方式存在局限性，對晚期的肝癌治療效果不佳，因此，多種局部治療方式聯(lián)合應(yīng)用的綜合治療為晚期肝癌患者提供了新的思路。前期的研究證實(shí)了RFA、TACE、HFH聯(lián)合的綜合治療能更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞和使腫瘤組織局限化，降低腫瘤的侵襲力，有效地激活HSP70和樹突狀細(xì)胞，增加機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫力[3-5]，改善預(yù)后，但是，缺乏對腫瘤持續(xù)殺傷作用的研究。Rai等[6]研究證實(shí)了RFA在治療后能夠產(chǎn)生持續(xù)一段時(shí)間的凋亡作用，并促進(jìn)HSP70蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫力。Gao等[7]對兔肝VX2腫瘤實(shí)驗(yàn)表明TACE在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面也存在一定的作用，與藥物聯(lián)合應(yīng)用后促凋亡作用明顯增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞對內(nèi)環(huán)境改變出現(xiàn)的一種生理變化，主要存在激活Fas的外源性信號(hào)通路和依賴Bcl蛋白家族的線粒體相關(guān)的內(nèi)源性信號(hào)通路，但最終細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)是Caspase家族，其中最重要的是Caspase-3蛋白，是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者之一。Takahashi等[8]研究表明熱損傷效應(yīng)可以通過破壞DNA雙鏈的穩(wěn)定性從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。Weinmann等[9]研究表明缺氧可以通過FADD／Caspase-8蛋白最終引起Caspase-3蛋白表達(dá)增多，促進(jìn)缺氧的細(xì)胞凋亡。RFA通過局部電流頻率達(dá)到一定值后引起組織內(nèi)帶電荷的離子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生熱效應(yīng)從而殺傷腫瘤細(xì)胞。TACE則是選擇性阻斷腫瘤的供血血管，使腫瘤細(xì)胞嚴(yán)重缺血、缺氧而出現(xiàn)局部的壞死。由此可以推斷RFA和TACE兩者之間對腫瘤的殺傷作用方式不同，促進(jìn)后續(xù)的腫瘤凋亡的靶點(diǎn)也是不同的，可以彼此增加之間的作用，有協(xié)同效應(yīng)。但RFA和TACE均為有創(chuàng)的治療方式，反復(fù)采用對機(jī)體影響較大，而HFH是采用高頻電磁場對腫瘤組織持續(xù)殺傷的無創(chuàng)性治療手段，對于加強(qiáng)RFA和TACE后續(xù)損傷作用更具有可操作性和易行性。本研究中TUNEL顯示凋亡指數(shù)在B組可以達(dá)到（25.11±1.998）%，可見三者聯(lián)合的綜合治療可以顯著提高治療的有效性。同時(shí)免疫組織化學(xué)法證實(shí)了Caspase-3在各組出現(xiàn)了表達(dá)，Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法顯示Caspase-3在該組表達(dá)最高。可見RFA＋TACE＋HFH聯(lián)合治療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)B組對肝功能損傷嚴(yán)重，綜合治療的安全性和優(yōu)勢值得有待更進(jìn)一步的評估。Li等[10]臨床研究表明索拉菲尼與RFA、TACE的綜合治療對于晚期肝癌患者是一種效果明顯且安全的治療方法。Kim等[11]認(rèn)為在治療2～5cm的肝癌時(shí)RFA與TACE聯(lián)合治療的效果可與手術(shù)結(jié)果相比，患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率與生存率方面比較差異不明顯。在回顧性分析中，可以發(fā)現(xiàn)TACE聯(lián)合RFA、PEI、HIFU或三維適形放療中任一局部治療方式，均比單一治療效果明顯，而且也能夠延長晚期肝癌患者的生存時(shí)間[12-15]。由此可見，綜合治療雖然對肝功能及機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷，但從對晚期肝癌患者的生存時(shí)間有明顯的延長作用，可以緩解癥狀，提高生活質(zhì)量的明顯優(yōu)勢來評估，是可以被接受和應(yīng)用的。在應(yīng)用綜合治療時(shí)應(yīng)結(jié)合患者的病情和基本身體情況，綜合評估權(quán)衡治療對患者帶來的弊與利。

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