吳春芳+李海洲+李富

[摘要] 目的 探討喉癌組織中存活素（Survivin）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達(dá)及其相關(guān)性。 方法 采用免疫組織化學(xué)鏈酶卵白素-生物素復(fù)合體（SABC）法檢測(cè)Survivin、MMP-2蛋白在92例喉鱗狀細(xì)胞癌及相距10 mm的癌旁組織和25例喉正常黏膜中的表達(dá)。 結(jié)果 Survivin在喉癌組織中的陽性率（76.09%）明顯高于癌旁（13.04%）及喉正常黏膜組織（8.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與臨床分期有關(guān)，與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度無關(guān)。MMP-2在喉癌組織中的陽性率（78.26 %）明顯高于癌旁（18.48%）及喉正常黏膜組織（12.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與分化程度和臨床分期有關(guān)，與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。兩者呈正相關(guān)。 結(jié)論 Survivin、MMP-2的異常表達(dá)可能對(duì)喉癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)喉癌的早期診斷、進(jìn)一步治療和判斷預(yù)后有一定參考價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 喉鱗狀細(xì)胞癌；存活素；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R739.65 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）01（a）-0009-04

惡性腫瘤最大的特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞生長失去可調(diào)控性，且具備浸潤潛能。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展需要充分的血管新生以提供足夠的營養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的增殖和血管新生均受細(xì)胞凋亡的影響，存活素（Survivin）是凋亡抑制蛋白家族的一個(gè)新成員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子[1]，惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，首先必須降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）是降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜所必需的，本實(shí)驗(yàn)對(duì)喉鱗癌組織中Survivin和MMP-2的表達(dá)情況進(jìn)行研究，探討其在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及兩者的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選用內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院一附院、山西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2006年10月～2007年8月、包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2008年7月～2013年12月手術(shù)治療并病理證實(shí)的92例喉鱗癌標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織（距離癌邊緣10 mm），25例喉正常黏膜，92例喉癌組織中，男性80例，女性12例；病理分級(jí)：高分化45例，中分化30例，低分化17例；病檢均為鱗狀細(xì)胞癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例；按UICC1995年分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期65例；所有患者術(shù)前均未行放療或化療。

1.2 方法

手術(shù)切除的組織標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、HE染色，連續(xù)切片每張厚4 μm，采用免疫組織化學(xué)鏈酶卵白素-生物素復(fù)合體法（SABC法），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。抗人多克隆抗體Survivin、兔抗人多克隆抗體MMP-2、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑均購自武漢博士德生物技術(shù)開發(fā)公司，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，將PBS代替一抗作陰性對(duì)照，試劑公司提供陽性對(duì)照，F(xiàn)HIT蛋白采用正常乳腺組織，Survivin蛋白采用乳腺癌。

1.3 結(jié)果判定

顯微鏡下觀察表達(dá)情況：在100倍視野下，觀察比較不同部位的染色強(qiáng)度。Survivin蛋白染色陽性細(xì)胞以胞質(zhì)呈黃色至棕黃色為主（圖1），偶見胞核表達(dá)[2-3]，MMP-2蛋白染色陽性細(xì)胞以胞質(zhì)呈黃色至棕黃色為主（圖2）。將染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。在400倍視野下，每例隨機(jī)選取不重復(fù)5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞所占百分比并計(jì)分。將陽性細(xì)胞百分比打分，0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。采取二次計(jì)分法[4]：染色強(qiáng)度與百分比的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽性。

圖1 Survivin在喉癌組織中的表達(dá)

圖2 MMP-2在喉癌組織中的表達(dá)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系的分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、MMP-2在喉癌、癌旁組織及正常喉黏膜的表達(dá)

Survivin在喉癌組織中染色陽性細(xì)胞數(shù)量及強(qiáng)度較其癌旁組織及正常黏膜明顯增多及增大，92例喉癌組織中Survivin陽性率為76.09%（70/92），相應(yīng)癌旁組織中Survivin陽性率為13.04%（12/92），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；25例喉正常組織中Survivin表達(dá)陽性率為8.00%（2/25），與喉癌組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MMP-2主要表達(dá)于喉癌組織細(xì)胞胞質(zhì)中，其蛋白低表達(dá)于正常喉黏膜組織中，92例喉癌組織中MMP-2陽性率為78.26%（72/92），相應(yīng)癌旁組織中MMP-2陽性率為18.48%（17/92），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；25例喉正常組織中MMP-2表達(dá)陽性率為12.00%（3/25），與喉癌組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與癌旁組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2 Survivin、MMP-2表達(dá)與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Survivin與臨床分期有關(guān)（P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、年齡無關(guān)（P>0.05）；MMP-2與分化程度、臨床分期有關(guān)（P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡無關(guān)（P>0.05）（表2）。

表2 Survivin、MMP-2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3 Survivin和MMP-2表達(dá)的相關(guān)性

在喉癌組織中，Survivin和MMP-2呈正相關(guān)（rs=0.45，P<0.05）（表3）。

表3 Survivin與MMP-2的相關(guān)性

3 討論

Survivin作為凋亡抑制蛋白家族中獨(dú)特的一員，參與細(xì)胞的分裂和增殖過程調(diào)節(jié)，在細(xì)胞凋亡抑制中起重要作用，其表達(dá)具有高度的特異性，除胎盤和胸腺組織外，在正常成熟組織不表達(dá)或低表達(dá)，而在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，與口腔鱗癌、肺癌、前列腺癌等存在關(guān)系[5-7]，提示Survivin在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用。Survivin可直接作用于Caspase，與之特異性結(jié)合，抑制Caspase-3、Caspase-7的活性，從而影響細(xì)胞內(nèi)微管的聚合、解聚，阻斷細(xì)胞的凋亡過程，對(duì)抗G2/M期凋亡的誘導(dǎo)，通過有絲分裂促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的異常增殖[8]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin的表達(dá)與癌旁及正常組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），癌旁組織表達(dá)高于正常喉黏膜，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在喉癌Ⅰ～Ⅱ期的表達(dá)率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統(tǒng)學(xué)意義（P<0.05）。與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、年齡無關(guān)（P>0.05），與Kato等[9]在食管癌組織中Survivin表達(dá)的研究結(jié)果一致。其他學(xué)者對(duì)Survivin的研究認(rèn)為其表達(dá)與喉癌臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[10-11]。

向周圍組織浸潤和從原發(fā)灶轉(zhuǎn)移到其他組織器官以及形成繼發(fā)腫瘤是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是影響治療效果和患者預(yù)后的重要因素，浸潤是轉(zhuǎn)移的起始步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MMPs亞型較多，主要通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)腫瘤血管生成引起腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，其中MMP-2起關(guān)鍵作用[12]，MMP-2又稱明膠酶A，專門負(fù)責(zé)降解基膜的主要成分Ⅳ型膠原。另外，有研究認(rèn)為 MMP-2可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，調(diào)節(jié)生長因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[13]，MMP-2過度表達(dá)有利于腫瘤細(xì)胞向鄰近組織、血管和淋巴管侵襲，導(dǎo)致腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移[14-16]。本研究表明，喉癌中MMP-2的表達(dá)與癌旁及正常組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），癌旁組織表達(dá)高于正常喉黏膜，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與喉癌臨床分期和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)學(xué)意義（P<0.05），與王曉茜等[17]的研究結(jié)果一致，Bogusiewicz等[18-19]對(duì)MMP-2的研究認(rèn)為，MMP-2在喉癌的浸潤過程中起著重要的作用，與喉癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。Krecicki等[20]的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，MMP-2與喉癌的臨床病理參數(shù)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)顯示，Survivin、MMP-2在喉癌中的表達(dá)呈正相關(guān)性（rs=0.45，P<0.05），兩者的表達(dá)均與臨床分期密切相關(guān)，由此推測(cè)，Survivin、MMP-2與喉癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，兩者可能通過凋亡抑制，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、基質(zhì)浸潤、微血管生成等多重途徑，共同促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此聯(lián)合檢測(cè)喉癌中Survivin、MMP-2的表達(dá)情況可作為判斷喉癌惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)，為揭示喉癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新線索，為深入認(rèn)識(shí)喉癌提供了新的思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ikehara M，Oshita F，Kameda Y，et al.Expression of survivin correlated with vessel invasion is a marker of poor prognosis in small adenocarcinoma of the lung[J].Oncol Rep，2002，9（4）：835-838.

[2] Badran A，Yoshida A，Ishikawa K，et al.Identification of a novel splice variant of the human antiapoptosis gene Survivin[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，314（3）：902-907.

[3] Okada E，Murai Y，Matsui K，et al.Survivin expression in tumor cell nuclei is predietive of afavorable prognosis in gastriec cancer patients[J].Cancer Lett，2001，163（1）：109-116.

[4] 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].癌癥雜志，1996，5，（4）：229-231.

[5] LoMuzio L，Staibano S，Pannone G，et al.Expression of the apoptosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma[J].Exp Mol Pathol，2001，70（3）：249-254.

[6] Chen XQ，Yang S，Li ZY，et al.Effects and mechanism of downregulation of survivin expression by RNA interference on proliferation and apoptosis of lung cancer cells[J].Mol Med Report，2012，5（4）：917-922.

[7] Roca H，Craig MJ，Ying C，et al.IL-4 induces proliferation in prostate cancer PC3 cells under nutrient-depletion stress through the activation of the JNK-pathway and survivin upregulation[J].J Cell Biochem，2012，113（5）：1569-1580.

[8] 董文榮，李曉明.凋亡抑制蛋白Survivin在腫瘤診斷與治療中的價(jià)值[J].疑難病雜志，2006，5（5）：397-397.

[9] Kato J，Kuwabara Y，Mitani M，et al.Expression of surviving in esophageal cancer：correlation with the prognosis and response to chemotherapy[J].Int Cancer，2001，95（2）：92-95.

[10] 朱瑾，徐如君，吳正虎，等.喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Survivin基因與p15和p16基因表達(dá)的關(guān)系[J].中華耳鼻咽喉科雜志，2004，39（6）：356-359.

[11] 王吉喆，關(guān)超，王壽忱，等.Survivin蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J].臨床耳鼻喉科雜志，2005，19（6）：247-249.

[12] Fang J，Shing Y，Wiederschain D，et al.Matrixmetalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（8）：3884-3889.

[13] Brinckerhoff CE，Rutter JL，Benbow U.Interstitial collagenases as markers of tumor progression[J].Clin Cancer Res，2000，6（12）：4823-4830.

[14] Vilaha A，Sahuquillo J，Poca MA.Matrix metaloproteinases in neumlogical brain lesions：a new therapeutic target[J].Rev Neural，2010，51（2）：95-107.

[15] Juan C，Manuel F，Lucas V，et al.Expression and clinical signifcance of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 in oral squamous cell carci-noma[J].Oral Oncol，2005，41（3）：283-293.

[16] Das S，Mandal M，Chakraborti T，et al.Structure and evolutionary aspects of matrix metalloproteinases：A brief overview[J].Mol Cell Biochem，2003，253（1-2）：31-40.

[17] 王曉茜，山艷春，王繼群，等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J].臨床耳鼻咽喉科雜志，2006，20（24）：1109-1110.

[18] Bogusiewicz M，Stryjecka-Zimmer M，Szymanski M，et al.Activity of matrix metalloproteinase-2 and -9 in advanced laryngeal cancer[J].Otolaryngol Head Neck Surg，2003，128（1）：132-136.

[19] Gorogh T，Beieru H，Baumken J，et al.Metallo-proteinases and their inhibitors：Influence on tumor invasiveness and metastasis formation in head and neck squarnous cell carcinomas[J].Head Neck，2006，28（1）：31-39.

[20] Krecicki T，Zalesska-Krecicka M，Jelen M，et al.Expression of type Ⅳ collagen and matrix metalloproteinase-2（typeⅣ collagenase） in relation to nodal status in laryngeal cancer[J].Clin Otolaryngol Allied Sci，2001，26（6）：469-472.

（收稿日期：2014-09-25 本文編輯：郭靜娟）