黨艷梅，李新建，張少青，曲小菡，魏明明，張昆(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濟(jì)寧272029)

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腎臟纖維化大鼠外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)變化及意義

黨艷梅，李新建，張少青，曲小菡，魏明明，張昆(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濟(jì)寧272029)

摘要：目的通過流式細(xì)胞儀對5/6腎切除大鼠外周血中的纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)變化，觀察外周血纖維細(xì)胞數(shù)量與腎臟纖維化程度之間的關(guān)系，探討外周血纖維細(xì)胞作為腎纖維化早期生物學(xué)標(biāo)志物的可行性。方法清潔級雄性SD大鼠10只，隨機(jī)分為對照組(n=4)和模型組(n=6)。模型組5/6腎切除制作腎臟纖維化模型，對照組只剝離腎包膜，不切除腎實(shí)質(zhì)。以CD45和Ⅰ型膠原作為循環(huán)纖維細(xì)胞的表面標(biāo)記，使用流式細(xì)胞儀對兩組大鼠外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)；結(jié)合腎功能生化指標(biāo)及腎臟病理學(xué)改變，分析循環(huán)纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)在腎纖維化中的意義。結(jié)果造模后第4、8、12周，模型組腎小球積分、腎小管間質(zhì)積分、血清肌酐、尿素氮均高于對照組(P均<0.01)。模型組在造模后的第4、8、12周，外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，高于對照組(P均<0.01)。外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)與血清肌酐、尿素氮呈正相關(guān)(r分別為0.623、0.550，P均<0.05)。結(jié)論外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)在腎纖維化早期與腎臟病理改變一致，可早期預(yù)示腎纖維化的發(fā)展進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：循環(huán)纖維細(xì)胞；慢性腎功能衰竭；腎臟纖維化；大鼠

研究表明，纖維細(xì)胞參與了多個(gè)臟器的纖維化，介導(dǎo)諸如腎纖維化、肺臟纖維化、支氣管哮喘、皮膚創(chuàng)傷以及內(nèi)膜增生等多種病理過程[1～5]。研究和尋找防治腎纖維化的新靶標(biāo)以及給予適時(shí)治療方略對進(jìn)一步改善慢性腎臟病(CKD)的預(yù)后至關(guān)重要。因此，我們通過對外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察循環(huán)中纖維細(xì)胞數(shù)量與腎臟纖維化之間的關(guān)系，探討外周血循環(huán)纖維細(xì)胞作為腎纖維化早期生物學(xué)標(biāo)志物的可行性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g清潔級雄性SD大鼠10只，隨機(jī)分為對照組(n=4)和模型組(n=6)。

1.1.2設(shè)備與試劑抗CD45-PE抗體(554878，BD)，兔多克?、裥湍z原抗體(ab292，Abcam)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體(A0562，碧云天)，淋巴細(xì)胞分離液(BV903200，上海拜沃)；DMEM培養(yǎng)液(11965-092，Gibco)；BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀。

1.2方法

1.2.1腎臟纖維化模型制備方法用10%水合氯醛腹腔麻醉，行左背旁正中縱切口，暴露左側(cè)腎臟，分離腎包膜，夾閉左腎蒂，剪掉左腎上下各1/3腎實(shí)質(zhì)，明膠海綿止血后殘腎還納入腹腔，逐層縫合，消毒。1周后切去右腎，即制備成5/6腎切除殘腎模型。對照組只剝離腎包膜，不切除腎實(shí)質(zhì)。

1.2.2標(biāo)本的留取方法對照組和模型組大鼠分別在手術(shù)后第4、8、12周留取外周血進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測，留取腎臟組織標(biāo)本用于腎臟病理染色。同時(shí)留取部分抗凝血進(jìn)行纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)的前期處理：肝素抗凝全血1 mL與等體積生理鹽水混合，緩慢加入含2 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，保持兩液面分界清晰，室溫下離心2 000 r/min×20 min。離心后，管內(nèi)液體分為3層，吸取中間淋巴細(xì)胞層約2 mL移入新的離心管中，加入10 mL生理鹽水，混勻后離心1 000 r/min×10 min。棄上清，加入1 mL細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌凍存管中，-80 ℃凍存1 d再轉(zhuǎn)入液氮中保存，在標(biāo)本收集完成后統(tǒng)一檢測。

1.2.3外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)方法取出凍存的白細(xì)胞樣本在37 ℃水浴中快速復(fù)融，1 500 r/min離心5 min，使用生理鹽水洗滌1次，并用預(yù)冷的生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀并分裝至1.5 mL EP管中。加入抗大鼠CD45-PE抗體，室溫孵育30 min。細(xì)胞經(jīng)過透化處理后加入100 μL生理鹽水洗滌2次。然后分別加入兔抗大鼠Col Ⅰ抗體，室溫孵育30 min并洗滌2次。最后FITC熒光染料標(biāo)記的兔二抗孵育，室溫30 min。細(xì)胞洗滌2次，用1%多聚甲醛溶液固定，上流式細(xì)胞儀分析。以CD45和Col Ⅰ作為循環(huán)纖維細(xì)胞的表面標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀對CD+45、Col Ⅰ+雙陽性的外周血白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以CD+45/Col Ⅰ+雙陽性細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)的百分比表示[6]。

1.2.4腎臟功能及病理評分方法取術(shù)后第4、8、12周留取的外周血，檢測Sor、BUN。參考Gadola等[7]所述方法，在光鏡下對腎臟病理進(jìn)行半定量積分。腎小球的硬化程度積分：0分(正常腎小球)；1分(系膜區(qū)擴(kuò)張或硬化面積<25%)；2分(硬化面積25%～50%)；3分(硬化面積50%～75%)；4分(硬化面積>75%)，每個(gè)標(biāo)本400倍光鏡下觀察20個(gè)腎小球，求平均數(shù)作為腎小球硬化指數(shù)。腎小管間質(zhì)積分：根據(jù)腎小管萎縮、管型、間質(zhì)炎癥和纖維化的范圍，分別給0～3分：0分(無小管間質(zhì)損害)；1分(病變范圍<25%)；2分(病變范圍25%～50%)；3分(病變范圍>50%)。在100倍光鏡下，每個(gè)標(biāo)本觀察10個(gè)視野，求平均數(shù)作為腎間質(zhì)小管病變指數(shù)。

2結(jié)果

2.1腎組織病理學(xué)改變對照組大鼠第4、8、12周腎小球、腎小管、間質(zhì)及血管無明顯改變。隨著造模時(shí)間延長，模型組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，腎小球包曼囊壁增厚或分層，部分可見壁層上皮細(xì)胞增生及球囊粘連，部分腎小球節(jié)段性或球性硬化；腎小管萎縮或代償性擴(kuò)張，部分出現(xiàn)顆粒變性及空泡變性；腎間質(zhì)增寬，可見大量灶性炎癥細(xì)胞浸潤及灶性纖維化。見插頁Ⅰ圖2。模型組的腎小球積分、腎小管間質(zhì)積分均顯著高于對照組(P均<0.01)。見表1。

±s)

注：與同周齡對照組比較，#P<0.05，*P<0.01。

2.2血生化檢測結(jié)果見表2。

2.3外周血循環(huán)纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)見表3。

2.4外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)與腎纖維化的關(guān)系將模型組大鼠循環(huán)纖維細(xì)胞與Scr、BUN及腎臟病理積分做相關(guān)性分析顯示，循環(huán)纖維細(xì)胞與Scr、BUN及腎臟病理積分均呈正相關(guān)(r分別為0.623、0.550、0.613，P分別<0.01、0.05、0.01)。

3討論

循環(huán)纖維細(xì)胞具有類似于成纖維細(xì)胞的功能如分泌膠原蛋白和其他基質(zhì)蛋白，同時(shí)還表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)記如CD34、CD45、MHC Ⅱ類分子等。因此，鑒別循環(huán)纖維細(xì)胞的基本標(biāo)準(zhǔn)是同時(shí)具有膠原生成和血源細(xì)胞標(biāo)記。當(dāng)前比較成熟的鑒定循環(huán)纖維細(xì)胞的標(biāo)記分子有CD34、CD45、Col Ⅰ等[8,9]。循環(huán)纖維細(xì)胞可以通過多個(gè)炎癥/免疫反應(yīng)機(jī)制，如抗原表達(dá)、分泌細(xì)胞因子和趨化因子、產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶等參與組織纖維化過程[10]。CCL2/CCR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是其發(fā)揮作用的一個(gè)重要途徑[11]。目前已多項(xiàng)研究證實(shí)，循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量與特發(fā)性肺炎、移植腎病變程度相關(guān)[12,13]。

腎纖維化的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)成分過度累積，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，糖蛋白和纖維連接蛋白等[14]。關(guān)于腎臟基質(zhì)細(xì)胞的來源有如下幾種可能：①腎臟固有間質(zhì)成纖維細(xì)胞被激活；②腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)；③來自血液循環(huán)中的纖維細(xì)胞浸潤[15]。纖維細(xì)胞在腎纖維化中的詳細(xì)作用機(jī)制尚不清楚，但既往研究證實(shí)纖維細(xì)胞確實(shí)參與了腎纖維化進(jìn)程中[16]。Sakai等[17]研究表明，在輸尿管結(jié)扎小鼠進(jìn)展性腎纖維化模型中，腎間質(zhì)可見CD45和Ⅰ型膠原雙陽性的纖維細(xì)胞浸潤，皮髓交界區(qū)尤為明顯。

±s)

注：與同周齡對照組比較，*P<0.01。

±s)

注：與同周齡對照組比較，*P均<0.01。

腎活檢病理檢查是確定腎臟損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其創(chuàng)傷性較大，并對操作技術(shù)有較高要求。因此，尋找更簡便的、適用于臨床的腎纖維化生物學(xué)標(biāo)志物，對腎纖維化早期監(jiān)測以及給予適時(shí)治療方略進(jìn)一步改善慢性腎臟病的預(yù)后至關(guān)重要。本研究以外周血循環(huán)纖維細(xì)胞作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，通過5/6腎切除大鼠腎衰模型，比較外周血纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化及與腎臟病理、血生化指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示，模型組大鼠外周血循環(huán)纖維細(xì)胞隨著腎臟損害的加重而逐漸增加，且與腎臟纖維化程度及血肌酐水平呈正相關(guān)，提示其可作為腎纖維化早期的生物學(xué)標(biāo)志物指標(biāo)。

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Significance of peripheral blood fibrocytes counting to renal fibrosis rats

DANGYan-mei,LIXin-jian,ZHANGShao-qing,QUXiao-han,WEIMing-ming,ZHANGKun

(AffiliatedHospitalofJiningMedicalCollege,Jining272029,China)

Abstract:ObjectiveTo discuss the significance of peripheral blood fibrocytes counting to renal fibrosis rats with 5/6 kidney cut. MethodsCD45and type I collagen were as the circulation fibrocytes surface markers; the flow cytometer was used to count the peripheral blood fibrocytes of rats with 5/6 kidney cut; biochemical indexes of renal function and the pathological alteration in kidney were measured. ResultsFor the model group of rats with renal failure, in 4, 8 and 12 weeks after modeling, the peripheral blood fibrocytes counting increased significantly compared with the control group (allP<0.01). The blood fibrocytes counting was positively correlated with renal pathology changes, Scr and BUN (P<0.05 orP<0.01). ConclusionThe peripheral blood fibrocytes counting is positively correlated with renal pathology changes in early renal fibrosis, which can indicate early the development process of renal fibrosis.

Key words:circulating fibrocytes; chronic renal failure; renal fibrosis; rat

(收稿日期：2014-11-06)

中圖分類號：R692.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)04-0021-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.007

作者簡介：第一黨艷梅(1963-)，女，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，腎內(nèi)科副主任，研究方向?yàn)槟I纖維化的早期診斷及治療。E-mail: dangyanmei@126.com

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2011HL017)。