陳穎(天津市人民醫(yī)院，天津300121)

·臨床研究·

肝細(xì)胞癌組織中miR-21、miR-26a及miR-338的表達(dá)及意義

陳穎(天津市人民醫(yī)院，天津300121)

摘要：目的探討肝細(xì)胞癌組織中miR-21、miR-26a及miR-338在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法選擇本院腫瘤中心組織標(biāo)本庫的肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本30例份(肝細(xì)胞癌組)及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本30例份(對(duì)照組)，采用Real-time PCR法檢測(cè)兩組miR-21、miR-26a及miR-338的表達(dá)，分析其表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果肝細(xì)胞癌組miR-21的表達(dá)高于對(duì)照組，miR-26a、miR-338表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.01)。肝細(xì)胞癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21相對(duì)表達(dá)量較高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不伴肝硬化、中低分化者miR-26a相對(duì)表達(dá)量較高，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有門靜脈癌栓者miR-338相對(duì)表達(dá)量較高(P均<0.05)。miR-21的表達(dá)與肝硬化、瘤栓、腫瘤分化和TNM分期等呈正相關(guān)( P均<0.05)；miR-26a的表達(dá)與肝硬化和腫瘤分化呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-338表達(dá)與腫瘤TNM分期和門靜脈癌栓呈正相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論miR-21表達(dá)增高、miR-26a及miR-338表達(dá)降低可促進(jìn)肝癌的發(fā)生及發(fā)展。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌；RNA，小分子干擾；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

多數(shù)肝細(xì)胞癌患者確診時(shí)已為晚期，預(yù)后差[1]。微小RNA(microRNA，以下簡(jiǎn)稱miRNA)是一類可負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)的非蛋白編碼的RNA家族，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。miRNA具有多種類型，可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)異常[1,6]。2010～2014年，我們檢測(cè)了30例份肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本中miR-21、miR-26a及miR-338的表達(dá)情況，探討其在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1材料肝組織標(biāo)本：選擇本院腫瘤中心組織標(biāo)本庫的肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本30例份(肝癌組)及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本30例份(對(duì)照組)。兩組均有完整的臨床病例資料，均經(jīng)病理檢查確診。按國際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)的分類標(biāo)準(zhǔn)和世界衛(wèi)生組織分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期4例、Ⅱ期7例、Ⅲ期15例、Ⅳ期4例。患者年齡35～68歲、平均50歲，術(shù)前均未接受化學(xué)和放射治療。試劑與儀器：Trizol購自Life Technologies公司；SYBR Green PCR Kit購自日本Toyobo公司；M-MLV Reverse TranscritaeKit購自美國ThermoFisher公司；miR-21、miR-26a、miR-338以及U6引物購自廣州銳博生物科技有限公司；熒光定量PCR儀購自Stratagene公司；分光光度計(jì)(RS232C)購自德國Eppendorf公司。

1.2miR-21、miR-26a及miR-338表達(dá)檢測(cè)采用Real-time PCR法檢測(cè)兩組miR-21、miR-26a及miR-338的相對(duì)表達(dá)量。常規(guī)Trizol試劑抽提組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10 μL，包括5×反轉(zhuǎn)錄引物0.5 μL、100 mmol/L dNTP與dTTP混合物0.15 μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL、RNA抑制劑0.5 μL及RNA 1 μg。反應(yīng)條件：42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、1 min變性，95 ℃、 15 s，60 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參照，分別進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用定量PCR中的相對(duì)定量法進(jìn)行分析，以2-△CT表示miR-21、miR-26a和miR-338的相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct= miRNA目的基因平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3miR-21、miR-26a及miR-338表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析肝細(xì)胞癌患者不同臨床病理特征(包括性別、年齡、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無肝硬化、腫瘤分化程度、包膜是否完整、有無門靜脈癌栓)與miR-21、miR-26a及miR-338相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性。

2結(jié)果

2.1miR-21、miR-26a及miR-338相對(duì)表達(dá)量肝癌組miR-21的表達(dá)高于對(duì)照組，miR-26a、miR-338的表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.01)。見表1。

表1　兩組miR-21、miR-26a及miR-338

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2miR-21、miR-26a及miR-338表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性①miR-21表達(dá)：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21相對(duì)表達(dá)量分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無肝硬化、中低分化及TNM分期Ⅰ～Ⅱ者(P均<0.05)；②miR-26a表達(dá)：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不伴肝硬化、中低分化者miR-26a相對(duì)表達(dá)量分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無肝硬化、高分化者(P均<0.05)；③miR-338表達(dá)：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有門靜脈癌栓者miR-338相對(duì)表達(dá)量分別高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ、無門靜脈癌栓者(P均<0.05)。miR-21的表達(dá)與肝硬化、瘤栓、腫瘤分化和TNM分期等呈正相關(guān)(r=0.675，P<0.05)，miR-26a的表達(dá)與肝硬化及腫瘤分化呈負(fù)相關(guān)(r=0.583，P<0.05)，miR-338表達(dá)與腫瘤TNM分期及門靜脈癌栓呈正相關(guān)(r=0.627，P<0.05)。3種microRNAs與性別、年齡、包膜完整性均無明顯相關(guān)性。見表2。

臨床病理特征nmiR-21相對(duì)表達(dá)量PmiR-26a相對(duì)表達(dá)量PmiR-338相對(duì)表達(dá)量P性別0.3250.4640.367 男21443.1±2.1350.2±2.0281.4±1.2 女9409.2±1.3321.6±1.3234.6±3.0年齡(歲)0.6310.2460.548 ≤5017439.1±2.3378.3±2.4362.4±2.2 >5013426.4±2.0404.5±1.3358.8±2.3TNM分期0.0320.0590.042 Ⅰ～Ⅱ11361.0±2.4402.9±2.0408.2±2.5 Ⅲ～Ⅳ19450.9±2.2389.9±2.0459.1±1.6淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0270.0150.008 有19551.2±2.0493.2±1.1321.3±2.1 無11412.7±2.0325.7±1.4465.4±4.0肝硬化0.0350.0410.211 有20491.8±2.2357.6±2.9389.8±2.0 無10390.1±1.1434.4±1.1431.2±2.2腫瘤分化0.0360.0460.056 高9488.2±2.0351.3±2.4411.4±2.3 中低21364.1±2.0473.2±3.0393.4±1.4包膜完整0.2210.3290.176 是8440.5±2.1401.8±2.7411.3±2.0 否22409.5±2.0449.2±3.0385.7±2.3門靜脈癌栓0.0790.1730.040 有10420.2±2.1401.8±2.7483.9±1.2 無20400.2±2.0449.2±3.0349.4±1.6

3討論

肝細(xì)胞癌最有效的方法是手術(shù)治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2,3]。尋找肝癌特異性的分子標(biāo)志物有助于肝癌的早期診斷。miRNA作為一種新的調(diào)節(jié)因子，不僅參與生物的生長(zhǎng)和發(fā)育等生命過程，而且可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，影響腫瘤患者的預(yù)后。miRNA可通過完全或不完全堿基配對(duì)與mRNA分子3′UTR端相結(jié)合，從而抑制靶基因的翻譯，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。

miR-21在多種腫瘤中均呈過表達(dá)，證實(shí)其在腫瘤形成過程中起廣泛的致癌作用，具有促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的功能。敲除腫瘤細(xì)胞中miR-21即可顯著上調(diào)抑癌基因PTEN的表達(dá)水平，通過調(diào)控抑癌基因PTEN的表達(dá)，影響其下游的磷酸激酶及基質(zhì)金屬蛋白酶，從而影響肝癌的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21表達(dá)與乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等有關(guān)，在惡性腫瘤的發(fā)病中發(fā)揮癌基因的作用[13]。miR-21在肝癌中的作用尚不明確。本研究肝癌組miR-21表達(dá)水平高于對(duì)照組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21表達(dá)水平較高，提示miR-21的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝硬化、腫瘤分化及TNM分期有關(guān)。

miR-26a位于人類3號(hào)染色體上，在多種組織中均有表達(dá)。大量研究表明，miR-26a可抑制鼻咽癌、乳腺癌、肝癌細(xì)胞的增殖，但卻可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[14]。因此，miR-26a在不同類型腫瘤中的作用還存在一定的爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中miR-26a的表達(dá)水平降低。本研究肝癌組miR-26a表達(dá)水平低于對(duì)照組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不伴肝硬化、中低分化者表達(dá)水平較高，提示miR-26a的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝硬化及腫瘤分化有關(guān)，miR-26a在肝癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)。

miR-338的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可通過抑制腫瘤中促進(jìn)增殖的基因表達(dá)從而加快分化進(jìn)程，具有抑癌基因的作用[15]。miR-338在肝癌中的表達(dá)情況尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組miR-338表達(dá)水平低于對(duì)照組，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有門靜脈癌栓者miR-338表達(dá)水平較高，提示miR-338的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期及門靜脈癌栓有關(guān)。

本研究表明，肝細(xì)胞癌組織中miR-21表達(dá)增高，miR-26a及miR-338表達(dá)降低，miR-21可能是肝細(xì)胞癌的致癌基因，miR-26a及miR-338可能是肝細(xì)胞癌的抑癌基因，且三種microRNA的表達(dá)與臨床病理特征存在一定關(guān)系，microRNA可能作為肝癌診斷和預(yù)后指標(biāo)提供依據(jù)。三種microRNA 可能互為靶點(diǎn)，相互作用，有待于進(jìn)一步深入研究。

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(收稿日期：2014-11-13)

中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2015)10-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.009