張 羽 ，石云良 ，吳文德 ，楊 磊 ，李 健，黃維義，

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530005 ；2.廣西大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究中心，廣西 南寧530005）

犬細小病毒病是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種常見烈性傳染病，具有高發(fā)病、高死亡率等特點。斷乳前后的仔犬易感性最高，死亡率可達10%～50%。犬巴貝斯蟲病是一種蜱傳性血液原蟲病，由犬巴貝斯蟲（Babesia canis）和吉氏巴貝斯蟲（B.gibsoni）引起，兩者在形態(tài)學(xué)上有明顯差別[1]。根據(jù)抗原性質(zhì)、交叉免疫、血清學(xué)試驗等可將犬巴貝斯蟲分為3 個亞種[2]：犬巴貝斯蟲亞種（B.canis canis）、韋氏巴貝斯蟲亞種（B.canis vogeli）和羅氏巴貝斯蟲亞種（B.canis rossi）。近年來，我國已經(jīng)有不少關(guān)于犬的巴貝斯蟲病的報道[3-4]。

筆者于2013 年11 月，對1 只羅威納病犬進行臨床與實驗室診斷，發(fā)現(xiàn)該犬為犬細小病毒與韋氏巴貝斯蟲的混合感染，診斷情況報告如下。

1 發(fā)病情況

2013 年11 月，某先生從廣西北海市購買1 只幼犬，免疫情況不詳，未驅(qū)蟲。兩天后，主訴：該犬精神不振，嘔吐，腹瀉（3 次），腹瀉物為黃色稀便。

2 臨床檢查

羅威納病犬，2 月齡，雄性。體溫39.9 ℃，精神不振，鼻鏡干，可視黏膜蒼白，皮膚無彈性，鼻及足墊未見角質(zhì)化，腹部觸診未見明顯異常，體表有蜱蟲，皮膚未見明顯損傷。

3 實驗室檢驗

3.1 檢測試紙法 使用韓國BIT 犬瘟熱病毒（CDV）、犬細小病毒（CPV）抗原檢測試劑盒、上?？祆`犬冠狀病毒（CCV）抗原檢測試劑盒，根據(jù)使用說明書進行取樣并檢測。

結(jié)果：CDV 陰性；CPV 陽性；CCV 陰性。

3.2 血常規(guī)檢查 對病犬進行靜脈無菌采集抗凝血。使用南京普朗全自動血球儀進行血液常規(guī)檢查，結(jié)果如表1。

結(jié)果分析：RBC↓、HCT↓表明該病犬可能有貧血；WBC↑表明該犬可能伴有并發(fā)癥，其中BASON↑、BASOP↑提示可能有寄生蟲感染。

表1 血液檢查

3.3 PCR 檢測

3.3.1 DNA 的提取 將抗凝血滴于Whatman FTA卡片上，使用FTA-DNA 直接提取法提取DNA。

3.3.2 引物的選擇 按照翟曉虎[5]報道的根據(jù)犬巴貝斯蟲18S rRNA 基因設(shè)計的犬吉氏巴貝斯蟲和犬巴貝斯蟲通用引物，預(yù)計擴增片段大小為339 bp，由華大基因科技服務(wù)有限公司合成，引物序列如下。

上游引物：5′-GTCTTGTAATTGGAATGATGGT GAC-3′，下游引物：5′-ATGCCCCCAACCGTTCCTA TTA-3′。

3.3.3 PCR 反應(yīng)的建立及產(chǎn)物鑒定 25 μL PCR反應(yīng)體系組成：2×Taq PCR Master Mix12.5 μL，l0 mmoL/L 上、下游引物各1μL，模板DNA 2 μL，補水至25 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)：94 ℃，預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸l min，重復(fù)10 個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降0.5 ℃；然后94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸l min，重復(fù)25 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

檢測結(jié)果：通過PCR 擴增，經(jīng)瓊脂凝膠電泳，擴增出大小約為339 bp 的DNA 片段，如圖1。

圖1 犬巴貝斯18S rR NA 基因PC R 擴增結(jié)果

3.3.4 序列測定及分析 將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果得到一條長度為294 bp 序列，將序列上傳到NCBI 并獲得登錄號：KJ000098。經(jīng)BLAST 軟件在線比對分析，顯示該序列與GenBank 中收錄的Babesia canis vogeli（登錄號為：KC989959.1）18S rRNA 基因序列同源相似性為100%。

4 討論

根據(jù)臨床發(fā)病癥狀可以初步診斷為犬細小病毒病，但是有時候很難與腸炎型犬瘟熱、犬冠狀病毒病及細菌性腸炎區(qū)別開。我們根據(jù)病犬臨床癥狀，并且使用了CDV、CPV、CCV 抗原快速檢測試紙來檢測，結(jié)果顯示CPV 陽性，CDV 與CCV陰性，確診為犬細小病毒病[6]。

該犬生前可視黏膜蒼白，血常規(guī)檢查中紅細胞數(shù)與紅細胞積壓降低，說明該病犬可能貧血，白細胞數(shù)增多表明該病犬可能有并發(fā)癥，其中嗜酸性粒細胞明顯增多，且體表發(fā)現(xiàn)蜱蟲，因此我們懷疑該犬可能還感染了其他的血液寄生蟲。為此，進行了犬的巴貝斯蟲PCR 檢測。引物參照翟曉虎[5]報道的犬吉氏巴貝斯蟲和犬巴貝斯蟲18S rRNA 基因通用引物，PCR 擴增、測序比對分析證實了犬韋氏巴貝斯蟲的感染。

病犬在確診為細小病毒感染后第2 天死亡，PCR 檢測證實該犬還存在有犬巴貝斯蟲感染。這種混合感染是否起到協(xié)同效應(yīng)，加速了病犬的死亡還要做進一步的研究。但是我們的檢測證實，細小病毒可以與犬巴貝斯蟲發(fā)生混合感染，在疾病的診治中，我們不能確診感染了細小病毒后就忽略犬巴貝斯蟲的存在。

[2] Nuttall G H F.On haematozoa occurring in wild animals in Africa[J].Parasitology，1910，3（1）：108-116.

[3] Carret C，Walas F，Carcy B，et al.Babesia canis canis，Babesia canis vogeli，Babesia canis rossi: differentiation of the three subspecies by a restriction fragment length polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes[J].Journal of Eukaryotic Microbiology，1999，46（3）：298-301.

[4] 權(quán)中會，魏莉，趙獻軍，等.西安地區(qū)犬吉氏巴貝斯蟲病的診斷與治療[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（4）：64-65.

[5] 金蘭梅，伍清林，董尹波，等.巴貝斯蟲病在南京寵物犬中流行情況的調(diào)查[J].金陵科技學(xué)院學(xué)報，2005，21（4）：93-96.

[6] 翟曉虎，姚大偉，賀衛(wèi)華.一例犬吉氏巴貝斯蟲病的PCR 診斷[J].畜牧與獸醫(yī)，2011，43（12）：80-81.

[7] 史利軍，曾妮，李剛.犬細小病毒生物學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（4）：82-85.