王海鳳

（河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北 張家口 075000）

近年來，張家口地區(qū)奶牛業(yè)生產(chǎn)態(tài)勢良好，帶動了地方經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，但奶牛生殖系統(tǒng)疾病也隨之增多，其中子宮內(nèi)膜炎占相當(dāng)大比例，嚴(yán)重影響了奶牛的繁育性能和產(chǎn)奶量，嚴(yán)重者可因喪失經(jīng)濟(jì)價值而被淘汰，給養(yǎng)殖戶造成的危害非常嚴(yán)重，經(jīng)濟(jì)損失巨大。

國內(nèi)外學(xué)者對患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)菌群的分離鑒定研究表明，引起子宮內(nèi)膜炎的主要原因是病原微生物的感染[1]。包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲等。臨床上多使用抗菌藥物進(jìn)行治療，由于耐藥菌株不斷產(chǎn)生，不但療效不佳，而且導(dǎo)致用藥量越來越大，后者又使治療成本增加，還會引起乳產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)、帶來食品安全隱患。中藥在治療奶牛疾病方面具有巨大的潛力，在奶牛飼料中應(yīng)盡量添加中藥飼料添加劑，對影響牛奶質(zhì)量的主要疾病要進(jìn)一步推廣中藥防治。

由于本病病原菌的種類隨地域不同而有較大差異，張家口及其周邊地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率及主要致病菌缺乏相關(guān)資料，給臨床防治奶牛子宮內(nèi)膜炎造成很大難度。本試驗針對在張家口地區(qū)采集了疑似病例的奶牛子宮30 份（將30頭疑似病牛屠宰后取出整個子宮）進(jìn)行主要病原菌的分離和鑒定，確定患病奶牛發(fā)生子宮內(nèi)膜炎后主要致病菌，然后測定中藥對分離菌株的體外抑制作用，篩選治療奶牛子宮內(nèi)膜炎敏感性的藥物，為有針對性地制定本地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥制備 中藥黃芩、硼砂、連翹、蒲公英、淫羊藿、益母草、紅花、當(dāng)歸、金銀花、板藍(lán)根、苦參、夏枯草等，購自張家口華佗藥房。

中藥煎液制備：各中藥用水浸泡12 h 后，將以上每種單藥加蒸餾水至中藥完全浸沒，置于電爐上急火煮沸，沸騰后開始計時，文火煎熬30 min后倒出藥汁，再加水同樣煮沸1 次，將兩次的煎液混到一起，紗布過濾后濃縮至20 mL，制成含藥量為1 g/mL 的煎劑，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病料采集 按照臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，在張家口壩上地區(qū)屠宰場將送去久配不孕即將淘汰的奶牛選出30 頭，經(jīng)過問診和直腸檢查暫定為子宮內(nèi)膜炎。奶牛屠宰后立即將子宮整體取出并采集子宮分泌物送實驗室進(jìn)行病原菌培養(yǎng)鑒定。

1.3 病原菌分離鑒定 將采集的子宮分泌物逐個接種于肉湯培養(yǎng)液，37 ℃增菌培養(yǎng)24 h；然后將增菌培養(yǎng)液劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離、培養(yǎng)。如此反復(fù)，直到培養(yǎng)基上的菌落特征相同時，再挑取單個菌落涂片，革蘭染色后鏡檢；根據(jù)菌落形態(tài)、菌體大小和染色特征，分別接種于鮮血培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，然后將菌株分別接種于血瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、S.S.瓊脂培養(yǎng)基等鑒別培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)。長好后用塑料袋裝好密封放于4 ℃冰箱中保存，進(jìn)行細(xì)菌的生化鑒定。菌種的保存則用含20%甘油的肉湯冷凍，-70 ℃保存。

將分離到的菌株逐個進(jìn)行生化反應(yīng)試驗[2]，主要包括以下幾方面試驗內(nèi)容：革蘭染色、溶血性、形態(tài)觀察、糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗（M.R.試驗）、乙酰甲基甲醇試驗（V-P 試驗）、硝酸鹽還原試驗、硫化氫試驗。最后根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色、鏡檢結(jié)果和生化反應(yīng)結(jié)果綜合分析，鑒定各菌株。具體細(xì)菌的鑒定參照《常見革蘭陽性菌的簡易鑒定方法》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《臨床細(xì)菌學(xué)》中的細(xì)菌分群方法進(jìn)行。

1.4 中藥抑菌試驗 采用平板打孔法[3]。分別取稀釋待測菌液于少量生理鹽水中制成0.5 號麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)菌液，用滅菌棉球?qū)⒋龣z細(xì)菌混懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面，再用直徑5 mm 的無菌打孔器在每個平皿內(nèi)均勻打5 個孔，挑去孔內(nèi)瓊脂，火焰加熱封底后注入各中藥液，以剛剛注滿為準(zhǔn)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h 后，測定抑菌圈直徑。對于抑菌圈直徑過大的或是沒有的進(jìn)行補(bǔ)做。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：由于目前沒有關(guān)于中藥抑菌圈直徑同藥物敏感性的關(guān)系，所以具體抑菌試驗結(jié)果只能用抑菌圈直徑表示，根據(jù)國家藥政管理局1995 年制定的中新藥申報指南中規(guī)定，中藥采用打孔法，中藥的抑菌圈直徑超過8 mm 者可判定為抑菌作用。

2 結(jié)果

2.1 患病奶牛病原分布和感染情況 本試驗對30 個奶牛子宮分泌物進(jìn)行細(xì)菌分離，共分離出6種主要病原菌，93 株，分別為大腸桿菌，葡萄球菌，鏈球菌，分泌屬化膿菌，蠟樣芽孢桿菌，沙門菌。單一感染和混合感染同時存在，混合感染高于單一感染（表1）。試驗表明，葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌。且從病料來源看（30 頭淘汰奶牛全部來自張家口市壩上周邊地區(qū)），該結(jié)論可以代表張家口市壩上周邊地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的真實性。

表1 病原菌各分離菌株的種類及部分特性

2.2 病原培養(yǎng)特性、染色特性和生化鑒定 經(jīng)無菌方式采取的不同奶牛子宮內(nèi)容物樣品，經(jīng)實驗室初步分離、純化后，涂片，鏡檢，根據(jù)菌落的培養(yǎng)時的形態(tài)特征，顯微鏡下細(xì)菌的形態(tài)特征，初步確定的細(xì)菌是革蘭陽性或陰性細(xì)菌，然后進(jìn)行生化鑒定，6 種病原菌生化鑒定結(jié)果見表2。

表2 生化鑒定結(jié)果

2.3 中藥的抑菌效果 采用打孔法進(jìn)行單味中藥的藥物敏感性試驗，對于不同的細(xì)菌，根據(jù)其不同的培養(yǎng)特性，采用不同的培養(yǎng)基，在其培養(yǎng)基上打孔后，注入藥液后，按照其特性，嚴(yán)格進(jìn)行培養(yǎng)，對6 種細(xì)菌進(jìn)行13 種單味中草藥的體外抑菌試驗，結(jié)果見表3。多數(shù)單味中藥對6 種細(xì)菌均有程度不同的抑制作用。其中以黃芩、硼砂、連翹、蒲公英、淫羊藿、大黃、丹參的抑菌效果較好。以單味藥對各種細(xì)菌抑菌圈直徑的平均值比較，排在前6 位的是淫羊藿（9.97）、硼砂（9.62）、黃芩（9.55）、蒲公英（9.5）、丹參（9.07）、連翹（8.98）。

3 討論

普遍認(rèn)為子宮內(nèi)膜炎的直接病因是產(chǎn)后各種病原微生物的感染所引起的，奶牛子宮內(nèi)膜炎病原微生物比較復(fù)雜，不同地區(qū)不同情況下分離到的細(xì)菌種類和比例也有差異[4]。本試驗對疑似子宮內(nèi)膜炎奶牛病原細(xì)菌進(jìn)行分離，張家口地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌為大腸桿菌，葡萄球菌，鏈球菌，分泌屬化膿菌，蠟樣芽孢桿菌，沙門菌等。分離到的細(xì)菌大多為廣泛存在于環(huán)境中及畜體內(nèi)的常見菌，其中有些是條件性致病菌，可見子宮內(nèi)膜炎是因奶牛產(chǎn)后體質(zhì)虛弱、免疫力下降，環(huán)境中及畜體內(nèi)病原微生物乘機(jī)侵入所致，這與我們進(jìn)行的病因?qū)W調(diào)查中發(fā)現(xiàn)奶牛場中存在的接產(chǎn)或人工授精時消毒不嚴(yán)及牛場衛(wèi)生條件較差的狀況相吻合。在所檢驗的30 頭患病奶牛中，單一感染和混合感染同時存在，主要為多種細(xì)菌的混合感染，這與地區(qū)性飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境因素有極大的關(guān)系，同時也與沒有及時進(jìn)行早期診斷治療有關(guān)。一旦一種病原微生物感染后，由于未能及時采取措施和早期治療，造成子宮內(nèi)膜和機(jī)體的抵抗力下降，極易誘發(fā)各種條件性病原微生物的繼發(fā)感染。由于混合感染的比例極高，導(dǎo)致治療上的難度增加，從而使治愈率下降。這也是當(dāng)前張家口奶牛子宮內(nèi)膜炎臨床治愈率低下的主要原因之一。本試驗中首先通過單味中藥的抑菌試驗，篩選出抑菌效果較好的中藥7 種：黃芩、硼砂、連翹、蒲公英、淫羊藿、大黃、丹參。

表3 單味中藥對6種分離細(xì)菌的抑菌圈直徑（mm）

[1]陳星，胡松華，張克春，等.奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：43-44.

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