陳希，穆祥，許劍琴

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

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LLO對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET-1的影響

陳希1，穆祥2*，許劍琴3*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

為探討李斯特菌溶血素(LLO)導(dǎo)致大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RIMVECs)損傷的作用機(jī)制，將體外培養(yǎng)的RIMVECs分為對照組和LLO組，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，測定細(xì)胞生長情況，并檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO、ET-1濃度變化。結(jié)果表明：LLO組RIMVECs的細(xì)胞間隙變大，有大量細(xì)胞碎片漂??；當(dāng)LLO濃度達(dá)到50ng/mL以上時，測得細(xì)胞增殖(OD值)均呈極顯著下降(P<0.01)；12 h內(nèi)，NO、ET-1分泌量高于正常水平。試驗(yàn)表明，LLO引起RIMVECs細(xì)胞因子NO、ET-1分泌量升高，導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境紊亂，是LLO導(dǎo)致腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

大鼠腸黏膜；微血管內(nèi)皮細(xì)胞；LLO；NO；ET-1

李斯特菌溶血素(Listeriolysin O，LLO)是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(L.monocytogenes，LM)的最主要毒力因子[1]。LM通過分泌LLO作用于內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌紊亂及細(xì)胞膜穿孔，進(jìn)而侵入細(xì)胞內(nèi)增殖并誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生病理癥狀[2-3]。LM在自然感染時，最主要的特征是入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤。因此，LLO可引起構(gòu)成血腦屏障和胎盤屏障的微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。作為一種重要的食源性細(xì)菌，LLO是否首先作用于腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并引起細(xì)胞損傷尚未見報道。由于不同組織器官的微血管內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能上存在異質(zhì)性，本研究以大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Rat Intestinal Mucosal Microvascular Endothelial Cells,RIMVECs)為研究對象，旨在了解LLO對腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；D-Hank’s干粉，Sigma公司；胰蛋白酶，Gibco公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，F(xiàn)BS,PAA公司；L-谷氨酰胺，Sigma公司；兔抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗血清，中杉金橋生物技術(shù)公司；羊抗兔IgG-FITC，中杉金橋生物技術(shù)公司；NO測試試劑盒，晶美生物工程有限公司；大鼠ET-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，美國R&B公司。Wistar大鼠，1日齡，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動物中心提供，符合國家實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 LLO的分離純化 參照文獻(xiàn)方法[4]，將培養(yǎng)的LM菌液離心通過0.22 μm過濾，硫酸銨沉淀、透析、濃縮處理后，通過SephadexG-100分子篩層析，洗脫回收。經(jīng)SDS-PAGE鑒定LLO為單條帶型，達(dá)電泳級純度，分子量為60000 Da。

1.3 RIMVECs的分離培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)方法[5]，選用1日齡Wistar大鼠，用外科手術(shù)方法獲得空腸，D-Hank’s液沖洗后，仔細(xì)撕除腸管漿膜層附著的腸系膜，暴露出腸黏膜微血管豐富組織。經(jīng)過胰酶消化，120～150 μm細(xì)胞篩過濾，與完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基、20%胎牛血清、2% L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素)混合，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應(yīng)用差速貼壁、胰酶消化和機(jī)械刮除法對培養(yǎng)細(xì)胞除雜純化，待純化細(xì)胞生長至80%融合時即可進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下，可見單層細(xì)胞呈典型的鋪路石狀相嵌排列。免疫熒光法檢測內(nèi)皮細(xì)胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗陽性(圖1)。

圖1 第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗鑒定陽性

1.4 細(xì)胞處理 試驗(yàn)使用第3代細(xì)胞。將融合生長的內(nèi)皮細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度5×108/L，每孔加150 μL完全培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合成單層細(xì)胞即行試驗(yàn)。

1.4.1 不同濃度LLO對RIMVECs形態(tài)及增殖的影響觀察 將培養(yǎng)板中已生長融合的RIMVECs分為空白組(LLO為0 μg/mL)和LLO處理組，按LLO終濃度分為5 μg/mL、1 μg/mL、500 ng/mL、50 ng/mL和5 ng/mL，每組設(shè)重復(fù)孔6個，空白組加維持培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及不同濃度LLO對細(xì)胞增殖的影響。

1.4.2 LLO對RIMVECs分泌NO、ET-1的影響觀察根據(jù)細(xì)胞增殖測定結(jié)果，將培養(yǎng)板中已生長融合的RIMECs分為空白組(LLO為0 g/mL)和LLO處理組(50 ng/mL)，每個組分5個不同時間段的亞組。每個亞組設(shè)5 個重復(fù)孔。空白組加維持培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)1、3、6、9、12 h 后收集上清液，3000 r/min離心5 min后，取上清于- 20 ℃條件下保存待測。

1.5 細(xì)胞增殖的測定 參照文獻(xiàn)方法[6]，采用MTT法測定細(xì)胞增殖情況，即將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5%CO2靜置培養(yǎng)24 h。吸凈細(xì)胞上清液后，在各孔細(xì)胞中加入5 mg/mL的MTT 30 (L及150 (L的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育30 min后，待細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測定各組OD值。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)NO及ET-1濃度的測定參照文獻(xiàn)方法[7]，采用硝酸還原酶法測定NO濃度，雙夾心ELISA法測定ET-1濃度，具體參照試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度LLO對RIMVECs形態(tài)及增殖的影響 細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，鏡下觀察LLO各濃度組和空白組細(xì)胞，對比發(fā)現(xiàn)，LLO處理組(5 μg/mL、1 μg/mL)可見大量漂浮細(xì)胞碎片，基本沒有殘存貼壁細(xì)胞；LLO處理組(500 ng/mL、50 ng/mL)可見不同程度的細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞碎片漂?。籐LO處理組5ng/mL和空白組細(xì)胞形態(tài)良好(圖2)。

從左到右LLO濃度依次為：1 μg/mL、500 ng/mL、50 ng/mL和0 ng/mL圖2 RIMVECs在不同濃度LLO作用下的形態(tài)學(xué)觀察(12 h)

LLO處理組(除5 ng/mL以外)，細(xì)胞增殖(OD值)均極顯著下降(P<0.01)低于對照組，且50ng/mL的LLO濃度即可抑制細(xì)胞增殖或?qū)?xì)胞造成損傷(圖3)。因此確定以50ng/mL的LLO濃度作為后續(xù)試驗(yàn)毒素作用濃度。

與空白組相比，**表示P<0.01圖3 不同濃度LLO對RIMVECs增殖的影響

2.2LLO對RIMVECs分泌NO和ET-1的影響 由表1可知，12h內(nèi)，各時間段LLO組NO分泌量均高于正常水平；細(xì)胞ET-1的分泌量如表2所示：各時間段LLO組ET-1分泌量均高于空白組。結(jié)果表明：在12h內(nèi)，50ng/mL的LLO可以引起RIMVECs分泌NO和ET-1升高，12h達(dá)到最高值。

表1 RIMVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO濃度的變化 μmol/L

表2 RIMVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液ET-1濃度的變化 pg/mL

2.3 LLO對RIMVECs細(xì)胞微環(huán)境NO、ET-1平衡關(guān)系的影響 由圖4可知，空白組RIMVECs的NO/ET比值維持在10左右，而LLO組比值隨時間逐漸下降，說明LLO可以破壞RIMVECs分泌NO、ET-1的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境紊亂。

圖4 不同時間段測得兩組細(xì)胞NO/ET-1的比值

3 討論與小結(jié)

3.1 LLO對RIMVECs形態(tài)及增殖的影響 血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是創(chuàng)傷、感染、休克、腫瘤、全身性炎癥反應(yīng)綜合征以及多器官功能障礙發(fā)生、發(fā)展的病理學(xué)基礎(chǔ)[8-10]。腸黏膜作為機(jī)體天然屏障部位，必然在腸道感染、細(xì)菌移位中起到關(guān)鍵作用，位于腸黏膜上的RIMVECs不僅是被動的靶細(xì)胞，更是一種效應(yīng)細(xì)胞[11]。據(jù)文獻(xiàn)報道[6]，LM通過分泌毒力因子LLO，可侵入多種宿主細(xì)胞，包括上皮細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、甚至巨噬細(xì)胞。在自然感染時，最主要的特征是入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤。因此，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的LM必須通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞作用穿過血腦屏障和胎盤屏障。同時，微血管內(nèi)皮細(xì)胞沿血液流動的方向，不僅構(gòu)成了血腦屏障，也構(gòu)成了肝、腎等其它組織器官內(nèi)血液與組織間的主要屏障。因此，LM引起各組織器官的損傷首先要通過微血管內(nèi)皮細(xì)胞并與其發(fā)生作用。目前，國外已有報道表示通過體外細(xì)胞試驗(yàn)(人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)證實(shí)了LM對血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激與損傷[7-8]。本研究表明，經(jīng)不同濃度的LLO處理后，RIMVECs的形態(tài)損害程度隨著LLO濃度的增加而加劇，細(xì)胞間隙逐漸增大，證明該內(nèi)皮細(xì)胞是LLO作用的靶細(xì)胞。LM感染后可通過釋放毒力因子LLO導(dǎo)致腸黏膜上的RIMVECs損傷，進(jìn)而突破腸黏膜屏障進(jìn)入血液。

3.2 LLO對RIMVECs分泌NO、ET-1及NO/ET比值的影響 NO是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的內(nèi)源性血管舒張因子[12]，作為一種重要的信使分子對于動、靜脈和微血管均有擴(kuò)張作用，能夠抑制缺氧引起的血管收縮，并具有神經(jīng)傳遞以及殺滅微生物和腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)功能[11]。而ET-1是目前已知的最強(qiáng)大的血管收縮劑，其作用正好同NO相頡頏。研究表明，NO的降低導(dǎo)致血管舒張水平降低，高濃度ET強(qiáng)烈收縮動、靜脈，尤以冠狀動脈、腎、腸系膜、腦及皮膚等微循環(huán)血管，加重微循環(huán)障礙及內(nèi)皮細(xì)胞損害，惡性循環(huán)致組織缺氧，細(xì)胞能量耗竭進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭的發(fā)生[13]。本研究表明，LLO可導(dǎo)致RIMVECs分泌NO、ET-1增多，NO/ET-1比值逐步下降，NO/ET-1平衡破壞，引起微循環(huán)障礙。同時，NO和ET-1的平衡關(guān)系被打破，微血管的緊張度發(fā)生異常改變，這可能是LM感染機(jī)體引起腸道組織損傷及機(jī)體多種組織器官病變原因之一。

本研究通過檢測LLO對體外培養(yǎng)RIMVECs的細(xì)胞形態(tài)、分泌NO、ET-1及NO/ET-1比值變化，確定LLO可直接損傷RIMVECs，并引起NO濃度升高以及ET-1的降低，說明LLO引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在李斯特菌病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。關(guān)于LLO引起NO、ET-1以及其他細(xì)胞因子紊亂的分子作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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(編輯：李文平)

Effects of Lipopolysaccharide on Secretion of NO and ET-1 of Rat Intestinal Mucosa Microvascular Endothelial Cellsinvitro

CHEN Xi1,MU Xiang2*,XU Jian-qin3*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China；2.BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)

The purpose of this study was to research on the functional mechanism of Listeriolysin O (LLO) damaging intestinal mucosa microvascular endothelial cells.Rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells (RIMVECs) were in culture divided into blank control group and LLO group.Cells were observed under microscope and assessed proliferation by MTT assay.The Changes of NO and ET-1 level in cell culture supernatants were measured.Compared with blank group,the intercellular space was enlarged in LLO group.Cell debris floated in culture medium.When the concentration of LLO was up to 50 ng/mL,proliferation of RIMVECs was very significantly decreased.The production of NO and ET-1 were enhanced for 12h.The functional mechanism of LLO damaging intestinal mucosa microvascular endothelial cells may be that LLO leads to the rise in the secretion of NO and ET-1.

intestinal mucosa；microvascular endothelial cells；LLO； NO；ET-1

北京市自然科學(xué)基金A類重點(diǎn)項(xiàng)目(6061001)；北京市教委人才強(qiáng)教“學(xué)術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”中藥方劑研究(5090245)

陳希，博士，從事中獸藥相關(guān)研究。

穆祥，muxiang1109@sina.cn；許劍琴，E-mail: jianqinxucau@126.com

2015-10-28

A

1002-1280 (2015) 12-0009-05

S852.44