陸 旋

（浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江 杭州 310018）

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了各種多肽類(lèi)藥物，多肽在臨床醫(yī)學(xué)中有巨大的應(yīng)用價(jià)值。自從發(fā)明固相法化學(xué)合成多肽以來(lái)，有關(guān)各種活性多肽的化學(xué)合成有了很大發(fā)展[1]。多肽是由蛋白質(zhì)中20 種氨基酸以不同組成和排列方式通過(guò)肽鍵（也稱(chēng)酰胺鍵）相互連接形成的化合物的總稱(chēng)[2]。本實(shí)驗(yàn)所用為較為復(fù)雜的12 肽。從現(xiàn)代分離科學(xué)理論得出，色譜和電泳是目前所知的分離效果最佳的兩種方法。電泳僅能用于分離而不能用于多肽的制備[3]。本實(shí)驗(yàn)所用為反相高效液相色譜法。反相高效液相色譜（RP-HPLC）是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑或其水溶液作為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)疏水性的差別進(jìn)行分離純化的洗脫色譜法[4]。RP-HPLC 主要用于分子量低于5000 的多肽的分離純化，因其具有分離效果好、分辨率高、重復(fù)性好、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。因此，RP-HPLC 是目前分離純化和制備多肽的主要手段[5]。本文擬用RP-HPLC 對(duì)化學(xué)合成的堿性疏水12 肽進(jìn)行分離、純化和制備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 多肽

合成的堿性疏水12 肽粗品由杭州中肽生化有限公司提供。其氨基酸序列如下所示：堿性疏水12 肽：Ala-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Pro-Ala-Thr-Gly-Gly-Lys（Biotion）。

1.1.2 試劑

制備級(jí)色譜乙腈；分析級(jí)色譜乙腈；三氟乙酸（TFA）（美國(guó)Sigma 公司）；純化水（哇哈哈有限公司桶裝20 L）；流動(dòng)相A 液[水+0.1% TFA（V/V/%）]；流動(dòng)相B 液[乙腈+0.1%TFA（V/V/%）]。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器：三角瓶、離心管、液氮瓶、攪拌棒、廢液瓶、藥匙。

設(shè)備：瓦里安HPLC 高效液相色譜儀（長(zhǎng)春博盛量子科技有限公司）、GLP-ID 25.4×450 mm C18100A 10um 制備色譜柱（成都格萊精密儀器有限公司）、Luna 5u C18（2）150×4.60 mm 5 micron 分析色譜柱（成都格萊精密儀器有限公司）、KH-300型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）、FA20043 萬(wàn)分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、TWT2003H 千分之一天平（杭州萬(wàn)泰天華儀器有限公司）、冷凍干燥機(jī)FD-1A-50（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、GPDG-25 進(jìn)口凍干機(jī)、HEWLETT SERIES// PACKARD 1090 Liquid Chromatograph。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多肽溶解

將裝在離心管里的堿性疏水12 肽固體用藥匙取適量放于燒杯中，碾成粉末，加入乙腈和水（7:3），將燒杯放于超聲波儀器中進(jìn)行攪拌溶解，直至溶液變得澄清透明。將溶解完的液體用循環(huán)水式真空泵過(guò)濾，收集并備用。

1.3.2 儀器處理準(zhǔn)備

以100%流動(dòng)相A 液沖洗RPLC 色譜柱8 min，然后進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫直至達(dá)到要求的B 液濃度[乙腈+0.1% TFA（V/V/%）]。

1.3.3 上樣

將B 泵放入溶解完的多肽中，設(shè)置A、B 泵流速為各50%進(jìn)行上樣，上樣中要多次少量的加溶劑使多肽完全進(jìn)入儀器中，上完樣停泵，設(shè)置合適的梯度進(jìn)行走樣。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)梯度方式，進(jìn)樣量進(jìn)行條件優(yōu)化，比較分析所得結(jié)果。

1.3.3.1 梯度方式的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以堿性疏水12 肽作為粗品，在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，選擇不同的梯度方式，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以尋找出在純化過(guò)程中最合適的線(xiàn)性梯度。線(xiàn)性梯度模式見(jiàn)表1。

1.3.3.2 進(jìn)樣量

以堿性疏水12 肽作為粗品，在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，選擇不同的進(jìn)樣量，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以尋找出在純化過(guò)程中最合適的進(jìn)樣量，使最后的收集量最大化。進(jìn)樣量改變見(jiàn)表2。

表2 不同進(jìn)樣量

1.3.4 樣品的收集

根據(jù)峰型收集各色譜餾分，保留并進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 儀器處理

收集完樣品后，用100 % B 液洗脫10 min，使殘余在柱上的物質(zhì)完全沖洗下來(lái),然后再用相應(yīng)濃度的A 液平衡色譜柱，以構(gòu)成一個(gè)完整的色譜過(guò)程。流速1.0 mL/min，堿性疏水12 肽的檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 RP-HPLC 對(duì)堿性疏水肽粗制品分析結(jié)果

以乙腈作為流動(dòng)相，用RP-HPLC 對(duì)堿性疏水12 肽的粗品進(jìn)行分析。圖1 為堿性疏水12 肽粗品的分析圖。

由圖1 可見(jiàn)，圖中出現(xiàn)了明顯的5 個(gè)峰，目標(biāo)峰為11.004 時(shí)出現(xiàn)的峰，峰的吸收不高，有很多雜峰，證明粗品的純度低，由圖可知，純度只有57.4%。粗品主峰附近有小峰，較難分離。

圖1 堿性疏水12 肽粗品的分析檢測(cè)圖

2.2 改變梯度方式對(duì)堿性疏水肽分離純化結(jié)果

圖2 30%→60%B 梯度RP-HPLC 色譜分離圖

圖2 為30%→60%B 梯度下的色譜分離圖，由圖可知目標(biāo)峰為色譜峰8，即含有所要收集的樣品，各小峰為分離出來(lái)的雜質(zhì)，色譜峰9、10、11為洗脫出來(lái)的無(wú)效峰，保留色譜峰8，用于檢測(cè)。

圖3 色譜峰8 的分析檢測(cè)圖

圖4 20%→40%B 梯度的RP-HPLC 色譜分離圖

圖3 為色譜峰8 的分析檢測(cè)圖，由圖中可見(jiàn)在30%→60%B 梯度下收集的目標(biāo)峰檢測(cè)結(jié)果為79.77%，純度與粗品相比有所提高，但效果不明顯。

由圖4 可見(jiàn)，在20%→40%B 梯度下的色譜分離圖，由圖可知目標(biāo)峰為色譜峰3，即含有所要收集的樣品，各小峰為分離出來(lái)的雜質(zhì)，保留色譜峰3，用于檢測(cè)。

圖5 色譜峰3 的分析檢測(cè)圖

圖5 為色譜峰3 的分析檢測(cè)圖，由圖中可見(jiàn)在20%→40%B 梯度下收集的目標(biāo)峰檢測(cè)結(jié)果為82.09%，純度與粗品相比大有提高，與30%→60%B 梯度下收集的目標(biāo)峰檢測(cè)相比也有所提高，但未達(dá)到目標(biāo)要求95%的純度。

圖6 25%→35%B 梯度的RP-HPLC 色譜分離圖

圖6 為25%→35%B 梯度下的色譜分離圖，由圖可知目標(biāo)峰為色譜峰3，即含有所要收集的樣品，各小峰為分離出來(lái)的雜質(zhì)，保留色譜峰3，用于檢測(cè)。

圖7 色譜峰3 的分析檢測(cè)圖

圖7 為色譜峰3 的分析檢測(cè)圖，由圖中可見(jiàn)在25%→35%B 梯度下收集的目標(biāo)峰檢測(cè)結(jié)果為96.62%，純度與粗品相比大有提高，與30%→60%B 和20%→40%B 梯度下收集的目標(biāo)峰檢測(cè)相比也大有提高，且純度超過(guò)所要求純度95%。

2.3 改變進(jìn)樣量對(duì)堿性疏水肽分離純化后成品效率的結(jié)果

由表3 可見(jiàn)進(jìn)樣量80 mg 到150 mg 逐漸增加的過(guò)程中，其純化后成品的效率也不斷提升，當(dāng)進(jìn)樣量超過(guò)150 mg 達(dá)到160 mg 時(shí)，其純化后成品的效率反而降低，在進(jìn)樣的過(guò)程中，應(yīng)選用150 mg。

表3 不同進(jìn)樣量的效率

3 結(jié)論

本文主要從純化過(guò)程中的進(jìn)樣量以及梯度方式兩個(gè)方面對(duì)堿性疏水12 肽的反相高效液相色譜進(jìn)行條件優(yōu)化，最后選擇線(xiàn)性梯度為25%→35%B，以150 mg 為進(jìn)樣量，作為最佳純化條件。在該優(yōu)化條件下，可收集目標(biāo)峰檢測(cè)純度為96.62%的堿性疏水12 肽，此結(jié)果不僅達(dá)到目標(biāo)要求，而且成品收集效率可高達(dá)80%。

[1]袁慶龍，候文義.Ni-P 合金鍍層組織形貌及顯微硬度研究[J].太原理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32（1）：51-53.

[2]李醫(yī)明.多肽類(lèi)PPLC 純化法[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2000，3（4）：351-355.

[3]張艷華，李影，巨芳，等.高效液相色譜分離純化多肽的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2009，9：34-36.

[4]Smith D D，Saha S，F(xiàn)ang G，et al.Modifications to the N—terminus but not the C-terminus of calcitonin generelated peptide（8-37）produce antagonists with increased affinity[J].Med Chem，2003，46（12）：2427-2435.

[5]郝志芳.利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析和制備多肽[D].常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，2009:1-19.