張鑫，吳劍平，嚴(yán)鳳，陸淳，顧欣

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海201103)

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基于雙柱固相萃取-色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時檢測雞肉中8種抗病毒藥物殘留

張鑫，吳劍平，嚴(yán)鳳，陸淳，顧欣*

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海201103)

建立了雙柱固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，可實現(xiàn)對雞肉中金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛胺、嗎啉胍、利巴韋林、阿昔洛韋、更昔洛韋、奧司他韋等8種抗病毒藥物的同時分析。采用三氯乙酸水溶液-乙腈對雞肉中8種抗病毒藥物殘留同時提取，依次通過石墨化碳柱和強(qiáng)陽離子交換柱以實現(xiàn)對目標(biāo)藥物的富集、凈化，選用石墨化碳色譜柱進(jìn)行分離，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。本文通過研究不同提取溶液、固相萃取柱及色譜柱對檢測結(jié)果的影響，最終建立優(yōu)化的檢測方法,采用外標(biāo)法計算，檢測限1 μg/kg，定量限2 μg/kg，添加濃度在2～200 μg/kg范圍內(nèi)的回收率大于80%，適用于雞肉中8種抗病毒藥物的同時分析。

石墨化碳；抗病毒藥物；殘留檢測

在我國金剛烷類、核苷類、雜環(huán)雙胍類以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑的抗病毒藥物都曾被報道用于獸醫(yī)臨床治療病毒感染[1]，近年來，為預(yù)防禽流感，抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)有濫用現(xiàn)象，2012年的“速成雞”事件中檢出雞肉中殘留有金剛烷胺和利巴韋林，給我國家禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的負(fù)面影響。抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的非法使用屢禁不止，同時國內(nèi)外對動物組織中的抗病毒藥物多殘留的檢測方法研究較少，給此類藥物的監(jiān)管帶來了不便。抗病毒藥物的作用機(jī)理和理化性質(zhì)各異，傳統(tǒng)前處理方法具有一定選擇性，且動物組織中藥物殘留量低，經(jīng)過復(fù)雜的提取凈化去脂步驟后，回收率不高，目前的文獻(xiàn)報道[2-4]檢測雞肉中的抗病毒藥物殘留的方法多局限與某一類抗病毒藥物，或采用通用的QuEChERS法進(jìn)行前處理，雜質(zhì)去除不夠充分，本文建立的雙柱固相萃取法是利用固相萃取柱對藥物的不同選擇性，將藥物分別保留在石墨化碳柱和強(qiáng)陽離子交換柱上，并通過洗脫液置換，將8種藥物濃縮在同一溶劑中，進(jìn)而實現(xiàn)了在液質(zhì)聯(lián)用儀上的同時分析，與目前有文獻(xiàn)[4-6]報道的方法相比，可同時檢測的藥物種類更多，操作簡便，檢測限更低，實用性和創(chuàng)新性較強(qiáng)。本研究建立的同時檢測雞肉中8種抗病毒藥物殘留量的檢測方法，對于有效監(jiān)控該類藥物的使用、保障我國動物性食品安全具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 Waters TQ Xevo串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(ESI+)、強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱(Waters MCX 3mL/60mg)、石墨化碳固相萃取柱(Thermo Hyper Carb 3mL/200 mg)、石墨化碳色譜柱(Thermo Hyper Carb 100 mm×2.1 mm，5 μm)；高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，美國Beckman Coulter)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。金剛烷胺(Amantadine，ATD)，金剛乙胺(Rimantadine，RTD)，美金剛胺(Memantine，MMT)，嗎啉胍(Moroxydine，MXD)，利巴韋林(Ribavirin，RBV)，阿昔洛韋(Acyclovir，ACLV)，更昔洛韋(Ganciclovir，GCLV)，奧司他韋(Oseltamivir，OSTV)(純度均≥99.0 %，德國Dr.Ehrenstofer GmbH)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國Merk)；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜方法 色譜柱：ThermoHyperCarb(100 mm×2.1 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量10 μL，流動相：A為乙腈，B為0.005 mol/L乙酸銨，采用梯度洗脫程序: 10%A起始保持1 min，2 min時變化至40%A，保持2 min，6 min時變化至10%A，保持2 min。

1.2.2 質(zhì)譜方法 質(zhì)譜條件為：選擇正離子模式，電離模式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度500 ℃；，碰撞氣壓力0.24 Pa，定性與定量離子對以及對應(yīng)的撞擊能量見表1。

1.2.3 前處理方法 取5 g雞肌肉置于離心管中，加2%三氯乙酸水溶液/乙腈(80:20)10 mL提取，Ika勻漿機(jī)勻漿1 min，震蕩提取15 min，10000 r/min離心5 min，取上清液依次通過HyperCarb柱(乙腈、甲醇各3 mL活化)和MCX柱(甲醇、水各3 mL活化)，0.2%甲酸水溶液/乙腈(60:40)1 mL洗脫HyperCarb柱,用試管收集洗脫液,備用，MCX柱依次用水、甲醇各3 mL洗滌，氨水甲醇3 mL洗脫，用試管收集洗脫液，N2吹干，殘渣用備用液溶解，上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測限、定量限和回收率 在空白雞肉中添加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其含量分別為2.0、10.0、50.0、200.0 μg/kg，每個濃度平行添加3份，重復(fù)3批次，按1.2.3項方法處理后測定，結(jié)果表明在2.0～200.0 ng/g內(nèi)回收率良好。以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限( LOD) 為1.0 μg/kg，以S/N≥10 確定方法的定量限( LOQ) 為2.0 μg/kg(表2、圖1)。

表1 抗病毒類藥物標(biāo)準(zhǔn)品及其內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)

* 定量離子對

表2 空白雞肉中添加8種藥物的添加回收率及批內(nèi)批間差異

續(xù)表

圖1 空白雞肉中8種抗病毒藥物MRM譜圖的信噪比(2 μg/kg)

2.2 前處理方法的選擇 為了研究不同前處理方法對藥物的選擇性，比較了直接提取法、分散固相萃取法以及固相萃取柱法。結(jié)果顯示，使用酸性水溶液或酸性乙腈直接提取可以提取出所有藥物，但稀釋倍數(shù)較大，酸性乙腈提取后可氮吹濃縮，濃縮倍數(shù)增加的同時，基質(zhì)干擾也較大；分散固相萃取法在酸性乙腈直接提取的基礎(chǔ)上加入C18粉和PSA會導(dǎo)致藥物回收率有一定降低；固相萃取柱法在提純和濃縮方面均有較好效果，但8種藥物的性質(zhì)差異較大，因此選用單一固相萃取柱無法將全部藥物都保留，需考慮串接固相萃取柱來實現(xiàn)對雞肉中所有抗病毒藥物的富集和凈化，嘗試采用混合陽離子交換柱(MCX)和石墨化碳固相萃取柱(Hypercarb)進(jìn)行串接，取得了較好的效果。

為保證藥物可同時被提取出來，又能夠在兩種小柱上實現(xiàn)分離和保留，還需要探討藥物的性質(zhì)、提取液的選擇、固相萃取小柱的選擇性以及色譜柱的匹配度等問題。

2.3 藥物性質(zhì)及提取液的選擇 表3給出了8種藥物理化特性的理論值，包括水溶解系數(shù)(LogS)、水油分配系數(shù)(LogP)、解離系數(shù)(pKa)等。8種藥物屬于不同類別的抗病毒藥物，溶解性質(zhì)和酸堿性質(zhì)差異較大，單用水相或有機(jī)相都不能實現(xiàn)完全提取，因此嘗試了甲酸水-乙腈、水-乙腈、乙酸銨-乙腈和三氯乙酸水溶液-乙腈4種提取液，結(jié)果顯示，2%三氯乙酸水溶液-乙腈(80/20)效果最好，一方面，可以提取全部藥物并起到沉淀蛋白的作用，另一方面，石墨化碳固相萃取柱能夠?qū)λ噍^多的體系進(jìn)行保留和凈化，而混合陽離子交換柱要求較低pH值，2%三氯乙酸水溶液-乙腈(80/20)同時滿足了上述全部條件。

表3 8種抗病毒藥物的溶解度參數(shù)及解離系數(shù)

2.4 固相萃取柱選擇性考察 研究了反相固相萃取柱(HLB)、混合陽離子交換柱(MCX)、石墨化碳固相萃取柱(Hypercarb)等對陽性添加樣品(2 μg/kg)的檢測結(jié)果。HLB回收率很低，不適合抗病毒藥物的分析，MCX和Hypercarb分別可實現(xiàn)對部分藥物的富集凈化，分析可能存在無保留或難以用同一種溶劑洗脫下來的情況，有文獻(xiàn)曾報道類似情況[8]，將兩者串聯(lián)使用，可最大程度的發(fā)揮兩者的作用，獲得所有藥物的較高回收率。試驗中發(fā)現(xiàn)，Hypercarb能夠保留的藥物更多且作用力較弱，易于被洗脫，因此，先通過Hypercarb，使藥物優(yōu)先保留在Hypercarb上，可防止藥物在MCX柱上產(chǎn)生較強(qiáng)的鍵合作用而影響回收率(表4)。

表4 雞肉中8種抗病毒藥物采用不同固相萃取柱凈化后的檢測結(jié)果

ND未出峰，○回收率<60%，√回收率≥60%，△回收率≥80%

2.5 色譜柱適用性考察 采用不同的色譜柱和流動相體系，會影響藥物的保留時間、出峰順序、響應(yīng)值等，本文比較了四種色譜體系：親水色譜柱(HILIC)、反相色譜柱(HSS T3)、正相色譜柱(BEH Amide)、石墨化碳色譜柱(Hypercarb)，不同前處理方法在4種色譜體系中的分析結(jié)果見表5。

雞肉中8種藥物經(jīng)QuEChERS法和Hypercarb-MCX法處理后在4種色譜體系中均有出峰，但QuEChERS法雜質(zhì)干擾明顯，峰型不佳，Hypercarb-MCX法的凈化效果有明顯改善；在反相柱體系中，利巴韋林和阿昔洛韋保留不佳，在1.2 min出峰，易受雜質(zhì)峰干擾；在親水色譜柱和正相色譜柱體系中金剛烷胺，金剛乙胺，美金剛胺，嗎啉胍，奧司他韋均在1.5～1.8 min出峰，易受雜質(zhì)峰干擾；在石墨化碳色譜柱體系中獲得了較滿意結(jié)果(圖2)。

表5 前處理方法與4種不同色譜體系匹配度的考察

圖2 陽性添加樣品雙柱法-石墨化碳柱色譜體系下的TIC圖(2 μg/kg)

3 小結(jié)

本文建立的雙柱固相萃取-串聯(lián)質(zhì)譜法將雞肉中8種藥物通過串接的固相萃取柱進(jìn)行充分的富集凈化，最終濃縮在1mL溶劑中，凈化效果更好，進(jìn)而采用對抗病毒藥物保留極佳的石墨化碳色譜柱進(jìn)行分離，減少了藥物在串聯(lián)質(zhì)譜上的基質(zhì)效應(yīng)和雜質(zhì)干擾，可使最低檢測濃度降低至1 μg/kg，較文獻(xiàn)方法更靈敏，準(zhǔn)確度更高，適合雞肉中多種抗病毒藥物殘留的定性定量檢測。

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(編輯：侯向輝)

Simultaneous Analysis of Eight Antiviral Drug Residues in Chicken Based on a Double-column Designed Solid Phase Extraction Combined with LC-MS/MS Method

ZHANG Xin, WU Jian-ping, YAN Feng, LU Chun, GU Xin*

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter，Shanghai201103，China)

A novel detection method based on a double-column designed solid phase extraction(SPE)combined with LC-MS/MS was developed for the simultaneous analysis of eight antiviral drugs residues in chicken, including amantadine, rimantadine, memantine, moroxydine, ribavirin, acyclovir, ganciclovir and oseltamivir. A graphitic carbon column and a strong cation exchange column were connected and used in series to enrich and purify the analytes from the trichloroacetic acid-acetonitrile aqueous solution.The eight drugs were separated by Hypercarb column and detected by LC-MS/MS method.The influences of the used dilutionsolvent, solid phase extractioncolumns andchromatographic columns on the test results were investigated to optimize the detection method. The results showed a low limit of detection down to 1 μg/kg. And the limit of quantization of 2 μg/kg was achieved. Moreover, the fortified concentrations could range from 2 to 200 μg/kg, and the recovery was higher than 80%. Hence, the detection method presented would be a promising candidate if the quick analysis for multicomponent and complicated samples was needed.

graphitic carbon; antiviral drug; residue detection

上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃：滬農(nóng)青字(2014)第2-5號；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203023)

張鑫，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析研究。

顧欣。E-mail：guxun@sh163.net

2015-08-03

A

1002-1280 (2015) 09-0045-06

S859.84