榮霞，王自力，張翥，涂君平，魏學(xué)良，金美蘭，別應(yīng)堂，張家驊

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716；2. 重慶市璧山區(qū)大興鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 404000；3. 重慶市光大(集團(tuán))有限公司，重慶 400020)

?

抑制奶牛乳腺炎致病菌的中藥復(fù)方篩選及其抗炎效果研究

榮霞1，2，王自力1，3*，張翥1，涂君平1，魏學(xué)良1，金美蘭1，別應(yīng)堂3，張家驊1

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716；2. 重慶市璧山區(qū)大興鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 404000；3. 重慶市光大(集團(tuán))有限公司，重慶 400020)

為研究可有效抑制奶牛乳腺炎主要致病菌的中藥復(fù)方及其抗炎效果，通過(guò)對(duì)黃連、黃柏、赤芍、苦參、連翹等5味中藥進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組方，采用平板打孔法、試管二倍稀釋法分別研究了各單味中藥及其復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌的體外抑菌效果，同時(shí)研究了篩選出的中藥復(fù)方的不同劑型對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的急性炎癥和棉球致肉芽腫的慢性炎癥的抑制效果。結(jié)果表明，對(duì)5味中藥的敏感性強(qiáng)弱依次為對(duì)無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌；中藥方劑3和方劑7對(duì)4種細(xì)菌的體外抑菌活性較強(qiáng)，且以方劑3的搽劑及膏劑對(duì)急、慢性炎癥具有良好的抑制效果。

奶牛乳腺炎；中藥復(fù)方；抗菌；抗炎

目前，我國(guó)奶牛乳腺炎的發(fā)病率較高，臨床型奶牛乳腺炎平均發(fā)病率為33.41%，隱性乳腺炎的平均陽(yáng)性率為73.91%，乳房患病率為44.74%[1]，其主要致病菌為金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌[2-3]。雖然用抗生素治療奶牛乳腺炎可取得較好的療效，但易導(dǎo)致藥物殘留和耐藥菌出現(xiàn)，嚴(yán)重危害奶業(yè)健康生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全。因此，研制低毒、低殘留且安全的中藥制劑來(lái)防治奶牛乳腺炎是重要的研究熱點(diǎn)之一[4]。本研究選取黃連、黃柏、赤芍、連翹、苦參等中藥，研究中藥及其復(fù)方對(duì)乳腺炎主要致病菌的體外抗菌活性及抗炎效果，為研制防治奶牛乳腺炎藥物提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 雄性昆明小鼠(22～25 g)70只，雌雄各半。隨機(jī)分為7組：陰性對(duì)照組(基質(zhì)搽劑組，基質(zhì)軟膏組)，陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松組)，中藥復(fù)方組(方劑3和方劑7)搽劑組及軟膏組，每組10只。

1.2 藥品與試劑 黃連、黃柏、赤芍、連翹、苦參，均購(gòu)自重慶市桐君閣大藥房。乙二胺四乙酸二鈉、液態(tài)石蠟，甘油，三乙醇胺，吐溫20、地塞米松、二甲苯、乙醚、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、十二烷基硫酸鈉、羥苯乙酯等均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

金黃色葡萄球菌，由西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；無(wú)乳鏈球菌(CVCC1886)，停乳鏈球菌(CAU0586)，大腸桿菌(CVCC1560)，均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.3 儀器與設(shè)備 RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、GHP-9080型隔水式培養(yǎng)箱、THZ-C型恒溫振蕩箱、722S可見(jiàn)分光光度計(jì)、SW-CJ-1Bμ型無(wú)菌工作臺(tái)。

1.4 方法

1.4.1 中藥提取及制劑 參照文獻(xiàn)方法[5]煎煮及提取藥物，即稱取相應(yīng)中藥，加水煮沸3次，雙層紗布過(guò)濾后，分別經(jīng)60%、80%無(wú)水乙醇于4℃醇沉12 h，3000 rpm離心15 min后，取上清液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 g生藥/mL。同時(shí)，參照文獻(xiàn)[6]制作軟膏基質(zhì)，將中藥提取液加入軟膏基質(zhì)混勻，制作成1 g生藥/g基質(zhì)的膏劑；另將乙醇、氮酮、吐溫20、蒸餾水按一定比例制成搽劑基質(zhì)，再與中藥提取液配制成1 g生藥/mL基質(zhì)的中藥搽劑，置于4℃保存。

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，考察黃連、黃柏、赤芍、連翹和苦參的醇沉水提物不同水平組方對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌的體外抑菌效果，選用正交表L8(25)。水平參照單味中藥(因素)的最大MBC值，中藥復(fù)方組成、水平和試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)見(jiàn)表1和表2。

表1 中藥復(fù)方組成因素和水平

表2 試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)及方案

1.4.3 中藥抑菌效果測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[7]，采用平板打孔法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 中藥最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[8]，采用二倍稀釋法和平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 抗炎效果研究

1.4.5.1 急性炎癥的抗炎效果研究 采用二甲苯致鼠耳腫脹法[9]制作急性炎癥模型。即在每只小鼠右耳涂抹二甲苯0.03 mL，致炎0.5 h后，基質(zhì)組鼠左右耳涂抹基質(zhì)；給藥組鼠左耳涂抹基質(zhì)，右耳涂抹復(fù)方中藥制劑，給藥4 h后，用直徑為6.0 mm的打孔器分別在小鼠兩耳同部位打下圓耳片，立即稱重，分別計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率。

耳腫脹度=M(右耳片)-M(左耳片)(M為質(zhì)量)

腫脹抑制率(%)=[(對(duì)照組腫脹度-給藥組腫脹度)/對(duì)照組腫脹度]*100%

1.4.5.2 慢性炎癥的抗炎效果研究 采用小鼠棉球肉芽腫法[9]制作慢性炎癥模型。即用乙醚吸入麻醉小鼠后，于無(wú)菌操作條件下將滅菌棉球(5mg)分別植入小鼠左右腋窩皮下，縫合皮膚；于術(shù)后次日給各組小鼠腋下棉球皮膚處均勻涂抹0.03mL藥物搽劑或0.03g藥物膏劑，連續(xù)給藥7d，每天2次。末次給藥1h后頸部脫臼處死小鼠，取出各組棉球肉芽組織，剔除脂肪組織后于80℃烘干12h至恒重，按如下公式計(jì)算肉芽腫組織重及增生抑制率：

肉芽組織重=植入棉球肉芽腫平均重量-植入棉球初重

增生抑制率(%)=[(對(duì)照組肉芽腫重量-給藥組肉芽腫重量)/對(duì)照組肉芽腫重量]*100%

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)形式表示。

2 結(jié)果

2.1 單味中藥及其復(fù)方體外抑菌效果 由表3可知，金黃色葡萄球菌對(duì)5種中藥的敏感度順序?yàn)椋狐S連、赤芍、苦參、連翹；無(wú)乳鏈球菌的敏感度順序?yàn)辄S連、赤芍、連翹、黃柏、苦參，且對(duì)除苦參外的4味中藥高度敏感；停乳鏈球菌的敏感順序?yàn)辄S連、黃柏、連翹、赤芍；大腸桿菌的敏感順序?yàn)辄S連、赤芍、連翹；黃柏僅對(duì)鏈球菌有抑制作用；苦參僅對(duì)金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌有抑制作用。

表3 5種中藥提取物對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(mm)

注:”—”表示無(wú)抑菌圈。所打孔孔徑為7 mm，抑菌直徑<10 mm為低度敏感，10～14 mm為中度敏感，15～19 mm為高度敏感，20 mm及以上為極敏，下同。

由表4可知，黃連對(duì)四種致病菌的MIC值最低，在0.0078～0.0625 g/mL之間?？傮w而言，5味中藥對(duì)鏈球菌的MIC值較低，尤其是黃連和黃柏；苦參的抑菌范圍較窄，僅對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，MIC為0.25 g/mL。

表4 5種中藥提取物對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(g/mL)

由表5所示，8個(gè)中藥復(fù)方對(duì)4種供試菌株均表現(xiàn)一定程度的抑制作用。其中，以方劑1、方劑3、方劑4、方劑7對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值較小，以方劑1、方劑3、方劑4對(duì)無(wú)乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑1、方劑3、方劑5、方劑7對(duì)停乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑2、方劑3、方劑7對(duì)大腸桿菌的MIC值較小；以方劑1、方劑3、方劑7對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC較小，為方劑3、方劑4、方劑5對(duì)無(wú)乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑1、方劑3、方劑5、方劑6、方劑7、方劑8對(duì)停乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑4、方劑1、方劑3、方劑7對(duì)大腸桿菌的MBC值較小。因此可知，以方劑3和方劑7對(duì)各致病菌具有較好的抑制作用。

表5 中藥提取物復(fù)方對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(g/mL)

由表6可知，直觀分析結(jié)果表明，對(duì)金黃色葡萄球菌的5味中藥的兩水平間極差均為0，各因素之間無(wú)主次之分；對(duì)無(wú)乳鏈球菌，黃連、赤芍和連翹的水平極差較大，最佳組方為A1B2C1D1E1；對(duì)停乳鏈球菌，黃柏、赤芍、連翹的水平極差較大，最佳組方為AB2C1D1E；對(duì)大腸桿菌，苦參的水平極差較大，且以1水平對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，最佳組方為A1B2C2D1E1。根據(jù)對(duì)以上各菌影響的主次順序綜合分析可知，中藥最佳組方為A1B2C1D1E1，最為接近的為方劑3(A1B1C1D1E1)。

2.2 中藥提取物復(fù)方的抗炎效果研究

2.2.1 對(duì)急性炎癥的抗炎效果

表6 不同組成的中藥提取物復(fù)方對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌抑菌效果的直觀分析

續(xù)表

注：表中a代表金黃色葡萄球菌，b代表無(wú)乳鏈球菌，c代表停乳鏈球菌，d代表大腸桿菌。

由表7可知，與基質(zhì)組相比，方3和方7搽劑組小鼠耳腫脹度均極顯著低于基質(zhì)組(P<0.01)，腫脹抑制率分別為54.7%、49.8%且低于地塞米松組；而方劑3和方劑7膏劑組與基質(zhì)組小鼠耳腫脹度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 對(duì)慢性炎癥的抗炎效果

表7 中藥提取物復(fù)方對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(n=10)

注：與基質(zhì)組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

由表8所示，與基質(zhì)組相比，方劑3和方劑7搽劑組小鼠肉芽腫重量均低于基質(zhì)組，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；方劑3軟膏組小鼠肉芽組織重顯著低于基質(zhì)組(P<0.05)，腫脹抑制率為40.4%，方劑7膏劑組則無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表8 中藥提取物復(fù)方對(duì)小鼠棉球致肉芽腫的影響(n=10)

3 討論與小結(jié)

根據(jù)中獸醫(yī)理論可知，奶牛乳腺炎是由于胃熱壅盛、氣血凝滯、胃脈受阻、乳腺靜脈阻塞或不暢而發(fā)生的[10]。從病原學(xué)上看，奶牛乳腺炎是由微生物感染引起的，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌為主，占感染病例的90%以上。因此，針對(duì)奶牛乳腺炎的發(fā)病機(jī)制和發(fā)病特點(diǎn)，本研究選用了具有清熱解毒、抗菌消炎、活絡(luò)通乳、消腫等功效的黃連、黃柏、赤芍、連翹和苦參[11]，比較各單味藥及其復(fù)方對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌的體外抑菌活性強(qiáng)弱及抗炎效果。

3.1 單味藥及復(fù)方的體外抑菌效果

本研究采用平板打孔法和二倍稀釋法考察5種中藥對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌的體外抑菌活性，以確定各致病菌對(duì)不同中藥的敏感性及敏感程度。有研究表明，連翹、黃柏、黃連對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及鏈球菌具有抑菌作用[12]，且黃連主要有效成分小檗堿具有體內(nèi)抑菌效果[13]。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連、黃柏、赤芍、連翹、苦參等5味清熱藥對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。其中，以黃連的抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)四株致病菌均表現(xiàn)為高敏，連翹、赤芍的對(duì)大腸桿菌抑菌活性較強(qiáng)，苦參對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定抑制作用，黃連、黃柏、赤芍、連翹對(duì)鏈球菌抑制作用較好。

通過(guò)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行組合中藥復(fù)方，考察復(fù)方對(duì)奶牛乳腺炎致病菌的MIC和MBC，MIC值越小，抑菌活性越強(qiáng)。本研究表明，各個(gè)復(fù)方對(duì)4種奶牛乳腺炎致病菌均有較強(qiáng)的抑菌活性。根據(jù)中獸醫(yī)學(xué)理論選用的中藥組成的中藥復(fù)方制劑對(duì)隱性乳房炎有一定的治療效果[14]。直觀分析得出，最佳組方為A1B2C1D1E1，即以方劑3對(duì)各菌的體外抑菌效果較好。方劑3的各單味中藥濃度均為最大水平，即一定濃度范圍內(nèi)，中藥濃度越高，抑菌活性增強(qiáng)。此外，方劑3的濃度比例為2∶2∶2∶2∶1，方劑7的濃度比例為1∶1∶1∶2∶1，即黃連：黃柏：赤芍為1∶1∶1，其配比可能具有協(xié)同作用，同時(shí)這三味中藥分別對(duì)四種菌有較強(qiáng)的抑菌活性，在復(fù)方中發(fā)揮著重要的協(xié)同抑菌作用。因此，本研究選用方劑3、方劑7作為受試中藥復(fù)方進(jìn)行抗炎試驗(yàn)。

3.2 不同劑型中藥復(fù)方的抗炎效果

目前防治奶牛乳腺炎的藥物劑型以透皮劑為主，中藥透皮給藥具有療效好、毒副作用小、無(wú)肝首過(guò)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[15]，對(duì)治療奶牛乳腺炎有廣闊的臨床應(yīng)用前景[16]。在本研究中，采用氮酮為透皮促滲劑制作中藥復(fù)方搽劑，同時(shí)制作膏劑以研究其抗炎效果。

本研究表明，針對(duì)二甲苯引起小鼠耳廓腫脹的急性炎癥，中藥復(fù)方搽劑效果優(yōu)于膏劑，且以方劑3效果最好；針對(duì)干棉球引起的肉芽腫的慢性炎癥，中藥復(fù)方膏劑效果優(yōu)于搽劑，亦以方劑3效果最好。研究表明，氮酮作為透皮劑，可迅速滲入皮膚角質(zhì)層，脫去細(xì)胞間脂質(zhì)形成孔道，增加角質(zhì)層含水量，降低角質(zhì)層的相轉(zhuǎn)變溫度，增強(qiáng)藥物的滲透作用[17]。因此，中藥搽劑具有藥物吸收較快、藥效快、對(duì)急性炎性效果較好的特點(diǎn)；而膏劑具有藥物作用時(shí)間長(zhǎng)、藥效穩(wěn)定特點(diǎn)，主要用于慢性疾病的治療[18]，故對(duì)慢性炎癥效果較好。

同時(shí)，方劑3的搽劑及膏劑抗炎效果均優(yōu)于方劑7，且方劑3中黃連、黃柏及赤芍藥物含量高于方劑7。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，黃連的主要有效成分是黃連堿，具有抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用；黃柏煎劑具有明顯的抗炎效果[19]；且赤芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛功效[20]，因此，說(shuō)明復(fù)方中黃連、黃柏及連翹的藥物含量對(duì)抗炎效果影響較大。

黃連、黃柏、赤芍提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌具有較強(qiáng)的體外抑菌活性，以中藥方劑3和方劑7的體外抑菌活性最強(qiáng)，且以方劑3對(duì)小鼠急、慢性炎癥的抑制效果最好，而單味中藥及其復(fù)方的體內(nèi)抑菌效果及抗炎機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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(編 輯：陳希)

Screening of Chinese Medicine Formula and Anti-inflammatory Effects of Chinese Medicine Formula with Antibacterial Activity to Mastitis Pathogens

RONG Xia1,2, WANG Zi-li1,3*, ZHANG Zhu1,TU Jun-ping1,WEI Xue-liang1, JIN Mei-lan1, BIE Ying-tang3, ZHANG Jia-hua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 2.DaxingTownanimalhusbandryandveterinarystationofBishancountyofChongqing404000,China; 3.ChongqingGondaGroupCo.，Ltd.,Chongqing400020,China)

In order to screen of Chinese herb extracts formula with anti-bacterial effects to major mastitis pathogens, then to study its anti-inflammatory effect, the experiment was carried out to learn the Chinese herbs including berberine, cork, red peony, sophora, forsythia designed in different Chinese medicine formulas by orthogonal test, and then to investigate the antibacterial effect of each single herb and their formulas againstStaphylococcusaureus,Streptococcusdysgalactiae,StreptococcusagalactiaeandE.coliinvitroby plate diffusion method, tube dilution method and plate count method. Also the inhibitory effect of different dosage forms of Chinese medicine formulas on xylene-induced ear edema in mice with acute inflammation and cotton induced chronic granulomatous inflammation are studied. The results show that the sensitivity of 4 bacteria to the 5 herbs were successivelyStreptococcusagalactiae,Streptococcusdysgalactiae,StaphylococcusaureusandE.coli, the formula 3 and 7 exhibit with strong antibacterial activity and the formula 3 has a good anti-inflammatory effect to acute and chronic inflammation.

mastitis; Chinese herbal compound; antibacterial; anti-inflammatory

重慶市應(yīng)用開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014yykfB10001)；重慶市博士后特別資助項(xiàng)目(XM20120050)，西南大學(xué)2014年學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2362014xk18)

榮霞，碩士研究生，從事動(dòng)物產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫方面研究。

王自力。E-mail: wzl9698@126.com

2015-07-10

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1002-1280 (2015) 08-0025-07

S853.76