葉妮，孫雷，尹暉，王亦琳，畢言鋒，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京 100081)

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UPLC-MS/MS法檢測(cè)動(dòng)物性食品中19種β-受體激動(dòng)劑殘留

葉妮，孫雷，尹暉，王亦琳，畢言鋒，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京 100081)

建立了前處理過程較為簡便、能同時(shí)檢測(cè)豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋中特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、西布特羅、克侖塞羅、羥甲基克倫特羅、克侖丙羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅、溴布特羅、克侖潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅19種β-受體激動(dòng)劑的UPLC-MS/MS方法。樣品經(jīng)乙腈-異丙醇混合溶液(4∶1，V/V)提取后，用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，然后用UPLC BEH C18色譜柱分離，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，基質(zhì)匹配溶液內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：19種β-受體激動(dòng)劑在1～50 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.990；在豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋中的檢測(cè)限均為0.1 ng/kg，定量限均為0.5 ng/kg。從0.5、1、2和5 ng/kg四個(gè)添加濃度檢測(cè)結(jié)果可以看出，19種藥物的回收率范圍為60%～120%，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、定性準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

動(dòng)物性食品；β-受體激動(dòng)劑；殘留；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

β-受體激動(dòng)劑(β-agonists)是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類衍生物，為兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的化學(xué)類似物。一般可分為含取代基的苯胺型(如克侖特羅)、苯酚型(如沙丁胺醇)、苯二酚型(如特布他林)三大類[1]。該類藥物主要用于防治人和動(dòng)物支氣管哮喘和支氣管痙攣。80年代，國內(nèi)外研究表明，在飼料中添加此類藥物具有營養(yǎng)再分配作用，可明顯提高動(dòng)物瘦肉率，因此曾被作為藥物促生長添加劑被廣泛關(guān)注[2]。而人食用了有這類藥物殘留的畜禽產(chǎn)品后會(huì)出現(xiàn)面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應(yīng)癥狀，嚴(yán)重者可危及生命[3]。因此歐盟、美國等先后立法禁止在畜禽生產(chǎn)上使用該類藥物[4]，我國政府也明令禁止其使用，我國農(nóng)業(yè)部先后發(fā)布了176號(hào)公告、235號(hào)公告和1519號(hào)公告，先后共禁止使用16種β-受體激動(dòng)劑類藥物[5-7]。

目前，關(guān)于動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)方法已有很多，主要有ELISA法、GC-MS法和LC-MS/MS法。其中ELISA法具有快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)藥物種類有限，且無法進(jìn)行多殘留檢測(cè)；GC-MS法可進(jìn)行多殘留檢測(cè)，但樣品前處理過程需衍生化，方法穩(wěn)定性和定性準(zhǔn)確性方面欠佳；LC-MS/MS法可進(jìn)行多殘留檢測(cè)，但現(xiàn)有方法前處理過程較為繁瑣，檢測(cè)動(dòng)物性食品的種類以及檢測(cè)藥物的種類相對(duì)較少。研究針對(duì)我國消費(fèi)量較大的豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋等10種組織，制定一種前處理過程快速簡便、能同時(shí)檢測(cè)19種β-受體激動(dòng)劑的UPLC-MS/MS方法，以保障對(duì)動(dòng)物性食品中該類藥物多殘留的確證檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acqutiy UPLC-Premier XETM質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters公司)；電子天平(Mettler Toledo 公司)；高速冷凍離心機(jī)(Heraeus公司)；氮吹儀(Jnc公司)；渦旋混合器、水平振蕩器(IKA 公司)。

1.2 藥品和試劑 特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、西布特羅、克侖塞羅、羥甲基克倫特羅、克侖丙羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅、溴布特羅、克侖潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅，純度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷、甲酸為色譜純(Fisher公司)；乙酸銨為分析純；所用水為超純水。

1.3 對(duì)照溶液配制 精密稱定適量的特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、西布特羅、克侖塞羅、羥甲基克倫特羅、克侖丙羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅、溴布特羅、克侖潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅對(duì)照品，用甲醇分別配制成1 mg/mL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，即得10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，從中準(zhǔn)確吸取0.1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于同一10 mL容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1∶9，V/V)稀釋并定容至刻度，即得100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取與酶解 準(zhǔn)確稱取2(±0.02)g試料于15mL塑料離心管內(nèi)，加入適量內(nèi)標(biāo)，加入6 mL乙腈-異丙醇混合溶液(4∶1，V/V), 渦旋混勻后，中速水平振蕩5 min，10000 r/min離心8 min，取上清液于55℃下氮?dú)獯抵两?。加?.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH=5.2)2 mL，充分溶解，再加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL[4]，渦旋混勻，于55℃下避光水浴振蕩2 h。取出后放置至室溫，加甲醇4 mL，渦旋混勻，肌肉和腎臟組織8000 r/min離心5 min，上清液備用；肝臟組織8000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一15 mL塑料離心管內(nèi)，加入3 mL正己烷，充分渦旋后，8000 r/min離心5 min，棄上層溶液，下層溶液備用；雞蛋加入3 mL正己烷，充分渦旋后，8000 r/min離心5 min，棄上層溶液，下層溶液備用。

1.4.2 樣品凈化 混合型陽離子交換固相萃取柱(500 mg/6cc)依次用甲醇、2%甲酸溶液各5 mL活化，取各組織備用液全部過柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各5 mL淋洗，抽干，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫。洗脫液于50℃下氮?dú)獯蹈?，殘余物中加甲?0.1%甲酸溶液(1:9，V/V)0.5 mL，充分溶解，取上清液適量，過0.2 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～2 min，5%A線性變化至10%A；2～12 min，10%A線性變化至60%A；12～14.5 min，維持100%A，14.5～16.5 min，維持10%A；流速為0.3 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；毛細(xì)管電壓為3.2 kV；萃取電壓為3.0 V；預(yù)六極桿電壓為0.5 V；源溫為110℃；脫溶劑溫度為350℃；脫溶劑氣速為650 L/Hr；錐孔反吹氣速為50 L/Hr。

1.5.3 定性與定量 該方法定性需滿足四個(gè)條件：① 空白實(shí)驗(yàn)不出現(xiàn)與陽性對(duì)照相同的離子峰；② 特征離子色譜峰信噪比(S/N)都在3∶1以上； ③ 試樣色譜峰保留時(shí)間應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差為±2.5%；④ 檢測(cè)到的離子豐度比應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差達(dá)到歐盟2002/657/EC中的規(guī)定。定量時(shí)以響應(yīng)強(qiáng)度最強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子，通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的提取與酶解 現(xiàn)有β-受體激動(dòng)劑的前處理幾乎均是用pH=5.2的乙酸銨緩沖液進(jìn)行提取，然后用濃氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至堿性，進(jìn)而再采用有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取。其中用乙酸銨緩沖液進(jìn)行提取對(duì)部分β-受體激動(dòng)劑的提取效率不高，用極性大的乙腈進(jìn)行提取的提取效率較高，同時(shí)加入少量的異丙醇有利于極性偏低藥物的有效提取(美國FSIS檢測(cè)SOP)，本方法采用乙腈-異丙醇(4∶1，V/V)直接對(duì)樣品進(jìn)行提取，可以同時(shí)有效提取其中的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的β-受體激動(dòng)劑，同時(shí)通過高速離心又能很好的去除蛋白質(zhì)等大量的干擾雜質(zhì)，為后續(xù)的酶解和凈化奠定基礎(chǔ)。

因大多數(shù)β-受體激動(dòng)劑類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝過程中很容易發(fā)生Ⅱ相軛合反應(yīng)，主要是與葡萄糖醛苷或芳基硫酸相結(jié)合，且結(jié)合態(tài)的藥物極性比原型更強(qiáng)，因此在用極性的乙腈-異丙醇混合溶液提取時(shí)游離態(tài)的原型藥物和結(jié)合態(tài)的藥物都能提取出來，提取后再進(jìn)行有效的酶解，可以減少大量雜質(zhì)的干擾。

2.2 樣品的凈化 β-受體激動(dòng)劑屬于偏堿性的化合物，商品化的混合型陽離子交換固相萃取柱以陽離子交換和反相固相萃取為基礎(chǔ)，非常適合堿性化合物的陽離子交換和反相吸附，因此本方法采用該類型的固相萃取小柱進(jìn)行凈化。由于樣品中可能含有脂肪等成分，尤其是雞蛋樣品和肝臟樣品，可能含有較多的脂溶性雜質(zhì)，因此對(duì)于肝臟、雞蛋等樣品在萃取柱凈化之前采用正己烷進(jìn)行除脂，起到了很好的凈化效果。

2.3 分析方法評(píng)價(jià)2.3.1 監(jiān)測(cè)離子 按照歐盟對(duì)違禁使用獸藥殘留確證檢測(cè)的要求，要確證β-受體激動(dòng)劑至少需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)，因此利用串聯(lián)質(zhì)譜儀選擇每種藥物的母離子以及對(duì)應(yīng)的兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子，通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子(MRM)方式進(jìn)行采集，這樣一個(gè)母離子1個(gè)IP點(diǎn)，對(duì)應(yīng)兩子粒子分別1.5個(gè)IP點(diǎn)，剛好滿足4個(gè)IP點(diǎn)的要求。根據(jù)9種β-受體激動(dòng)劑一級(jí)質(zhì)譜掃描和二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定了各自的監(jiān)測(cè)離子(表1)。

表1 19種β-受體激動(dòng)劑及同位素內(nèi)標(biāo)的定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓、碰撞能量參考值

續(xù)表

2.3.2 方法線性 分別精密量取適量的克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等19種標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得濃度為1、2、5、10、20、50 ng/mL(有內(nèi)標(biāo)物的其內(nèi)標(biāo)濃度均為10 ng/mL)各系列對(duì)照溶液0.5 mL，加入到經(jīng)提取、酶解、凈化后的樣品基質(zhì)中，值得對(duì)應(yīng)的基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。內(nèi)標(biāo)法以各特征離子質(zhì)量色譜峰與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。外標(biāo)法以各特征離子質(zhì)量色譜峰為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以雜質(zhì)較復(fù)雜切前處理步驟較為繁瑣的豬肝臟組織為例，由19種β-受體激動(dòng)劑類藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2(表2)可以看出：19種β-受體激動(dòng)劑類藥物在1～50 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均大于0.990。

表2 豬肝臟組織中19種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

續(xù)表

2.3.3 方法靈敏度和精確度 采用空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>3為方法檢測(cè)限，S/N>10為方法定量限，得出特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇等19種β-受體激動(dòng)劑在樣品中的檢測(cè)限均為0.1 ng/g，定量限均為0.5 ng/g。

1 ng/g空白豬肝添加試液中19種β-受體激動(dòng)劑及同位素內(nèi)標(biāo)的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

圖1 1μg/kg空白豬肝添加試液中19種β-受體激動(dòng)劑及同位素內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色譜圖

采用標(biāo)準(zhǔn)添加方法，在空白豬、牛、羊肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋中添加4個(gè)不同濃度(定量限、低、中、高四個(gè)濃度)的19種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，表3給出了基質(zhì)復(fù)雜的豬肝組織中19種β-受體激動(dòng)劑添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從表中可以看出本方法在空白豬肝中進(jìn)行0.5～5 ng/g的添加濃度，方法的回收率均為60%～120%，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

表3 豬肝組織中19種β-受體激動(dòng)劑添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

續(xù)表

3 結(jié)論

本方法通過對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的充分優(yōu)化改進(jìn)，建立了適用于豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋等10種動(dòng)物性食品中特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇等19種β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法。該方法前處理過程簡便、靈敏度和精確度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

[1] 朱堅(jiān),李波,方曉明. 氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定肝、腎和肉中11種β-受體激動(dòng)劑殘留量[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2005,03 :3-11.

[2] 孟娟，邵兵，吳國華. 氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物性食品中8種β-興奮劑的殘留量[J]:5-7.

[3] 劉敏，劉戎，王立琦.豬肝中β-受體激動(dòng)劑多殘留的樣品前處理方法比較及同時(shí)檢測(cè)[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2012, 03:56-61.

[4] 劉佳，梁桂榮，謝云峰.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬尿中26種β_2-受體激動(dòng)劑類藥物殘留[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2014,09:149-156.

[5] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告第176號(hào)禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄[S].

[6] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S] .

[7] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告第1519號(hào)禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)[S] .

(編輯：陳希)

農(nóng)業(yè)部公布81個(gè)獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄

(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2294號(hào))

為加強(qiáng)獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)管理工作，確保產(chǎn)品安全、有效、質(zhì)量可控，我部組織開展了獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)清理工作。經(jīng)研究，對(duì)不符合當(dāng)前國家動(dòng)物防疫政策、存在較大生物安全隱患、已被新產(chǎn)品取代且至少5年無企業(yè)生產(chǎn)，以及檢驗(yàn)項(xiàng)目不全、不能保證產(chǎn)品質(zhì)量的81個(gè)獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)予以廢止(見附件)，自本公告發(fā)布之日起執(zhí)行?，F(xiàn)就有關(guān)事項(xiàng)公告如下。

一、自本公告發(fā)布之日起，停止受理、審批上述81個(gè)獸用生物制品的產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)申請(qǐng)。

二、自2016年1月1日起，停止生產(chǎn)上述81個(gè)獸用生物制品，涉及相關(guān)企業(yè)的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)同時(shí)撤銷。2015年12月31日前生產(chǎn)的產(chǎn)品，可以在2016年12月31日前流通使用。

三、自2017年1月1日起，停止經(jīng)營、使用上述81個(gè)獸用生物制品。

附件：廢止獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)目錄(省略)

農(nóng)業(yè)部

2015年9月1日

摘自中國獸藥信息網(wǎng)

Determination of β-agonists in Animal Derived Food by UPLC-MS/MS

YE Ni1, SUN Lei1, YIN Hui1,WANG Yi-lin1,BI Yan-feng1, WANG He-jia1,XU Shi-xin1

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China；2JiangsuProvincialTestCentreofAnimalBy-ProductQuality，Nanjing210036，China)

A UPLC-MS/MS method was established for the determination of terbutaline, zilpaterol, salbutamol, cimaterol, cimbuterol, clenciterol, hydroxymethyl clenbuterol clenproperol clorprenaline, ractopamine, clenbuterol, tulobuterol, brombuterol, clenisopenterol, bambuterol, mabuterol, mapenterol, phenyl ethyl alcohol amine A and penbutolol residue in animal derived food. After the tissues were extracted by Acetonitrile-2-Methyl-1-propanol, enzymolysis,centrifuged, neutralized, followed by liquid-liquid extraction with ethyl acetate andtert-butyl methyl ether, respectively. The combined extracts were applied to a solid phase extraction MCX cartridge for cleanup. The separation of β-agonists was performed on Waters Acquity UPLC system with the column of BEH C18 and the gradient elutinon solvent of acetonitrile(0.1% formic acid) and water(0.1% formic acid) at a flow rate of0.3mL/min. The method was quantified by blank tissue spiked standard curves. The calibration curves were good linear between the peak areas and the concentrations of 1～50μg/kg，the correlation coefficient R2>0.990. The limits of detection of the 19 β-agonists in animal derived food were 0.1μg/kg, and the limit of quantification was 0.5 μg/kg. The average recoveries from spiked animal tissues at three concentrations of 0.5,1,2 and 5 μg/kg ranged 60%～120%. The intra- and inter-batch variation coefficients were both less than 20%.

animal derived food；β-agonists；residue；UPLC-MS/MS

葉妮,從事獸藥殘留相關(guān)方面工作。E-mail: yeni527@126.com

2015-08-13

A

1002-1280 (2015) 09-0051-09

S859.84