李艷忙，劉國(guó)林，喬晶，劉爽，張瑜，秦振嫻，劉勇

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

甘松為敗醬科植物甘松(Nardostachys chinensis DC.)的干燥根及根莖，具有理氣止痛，開(kāi)郁醒脾等功效，多用于治療脾胃氣滯、霍亂轉(zhuǎn)筋、脘腹脹痛、牙痛、痰眩、癔病癲癇、心悸怔忡、腳氣等［1］。甘松被列為我國(guó)二級(jí)保護(hù)藏藥，用藥歷史悠久，主要分布于甘肅、青海、四川、云南西北部、西藏等地［2］。甘松中倍半萜類(lèi)成分是甘松開(kāi)郁醒脾的有效成分，其中，甘松新酮是甘松中特有成分，生物活性研究表明，甘松新酮具有鎮(zhèn)靜、抗抑郁及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)等活性［3-9］;現(xiàn)代藥理研究表明，甘松可以治療慢性胃炎、胃潰瘍、腳氣等癥，而甘松中綠原酸具有抗菌消炎的活性［10-11］，是甘松抗菌消炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。為了保證甘松的藥材質(zhì)量和更好的應(yīng)用于臨床治療，筆者在前期研究基礎(chǔ)上采用HPLC法建立同時(shí)測(cè)定甘松中綠原酸和甘松新酮含量的方法，并對(duì)25個(gè)產(chǎn)地的甘松進(jìn)行初步研究分析，以期為藥典中甘松藥材增加甘松新酮的含量測(cè)方法、甘松資源的開(kāi)發(fā)利用和藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)和全面的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘松藥材(25個(gè)產(chǎn)地的樣品，于2013年7～8月份采自四川青海等地，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院石晉麗教授鑒定為敗醬科植物甘松);綠原酸對(duì)照品(中國(guó)生物制品藥品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)RA0426FA14);甘松新酮(自制，含量大于98%);Waters 2695高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器);Sartofius—BSll0S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);KQ-5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm，美國(guó)Agilent公司)，流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液。線性梯度洗脫，0～5min，A 10%;5～15min，A 10%～15%;15～22min，A 15%～30%;22～32min，A 30%～35%;32～40min，A35%～50%;40～50min，A 50%～65%;50～60min，A 65%。柱溫為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm;流速為1.0mL/min。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品4.26mg，甘松新酮對(duì)照品7.24mg，用甲醇配制成濃度分別為0.1704mg/mL、0.2896mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密移取綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液9mL，甘松新酮對(duì)照品儲(chǔ)備液15mL，混勻，配制成濃度分別為62.6μg/mL、177.3μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

稱(chēng)取各產(chǎn)地的甘松藥材粉末(過(guò)20目篩)約2g，精密稱(chēng)定，置于100mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100mL，密封后在室溫下超聲1h，提取2次，過(guò)濾后合并提取液，濃縮，最后用甲醇定容至25mL容量瓶?jī)?nèi)，取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.2.4 線性關(guān)系考察

高效液相色譜儀分別精密進(jìn)樣2，5，10，20，30，50μL混合對(duì)照品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。

1.2.5 精密度考察

在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣對(duì)照品溶液6次，每次10μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算儀器精密度。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

選取四川阿壩縣河支鄉(xiāng)的甘松樣品為供試品，精密稱(chēng)取6份樣品，按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算綠原酸、甘松新酮的峰面積的RSD值，以評(píng)價(jià)方法的重現(xiàn)性。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份甘松樣品，在室溫下放置，分別在0，2，4，8，12，24h進(jìn)樣10μL測(cè)定分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算綠原酸和甘松新酮的RSD，以評(píng)價(jià)供試品溶液的穩(wěn)定性。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已知含量(綠原酸、甘松新酮)的四川阿壩縣河支鄉(xiāng)的甘松樣品6份，每份約2g，精密稱(chēng)定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD值。

1.2.9 甘松樣品含量的測(cè)定

取不同產(chǎn)地的甘松藥材粉末，按“1.2.3”項(xiàng)下方法配制樣品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定綠原酸和甘松新酮的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算兩種成分在甘松樣品中的含量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照品與供試品溶液的色譜分析結(jié)果

對(duì)照品及供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，理論塔板數(shù)按綠原酸、甘松新酮和隱丹參酮計(jì)算均不低于5000，且三者分離度均大于1.5，分離效果好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

綠原酸的線性回歸方程為Y=755732X-27119，r=0.9993(n=6);甘松新酮的線性回歸方程為Y=368527X-8160，r=1(n=6)。結(jié)果表明綠原酸在0.1278～3.195μg，甘松新酮在0.3546～8.865μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

綠原酸峰面積的RSD為2.61%，甘松新酮峰面積的RSD為1.04%。結(jié)果表明儀器精密度符合要求。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 對(duì)照品和供試品HPLC圖

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，綠原酸、甘松新酮的RSD分別為1.67%、1.04%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

綠原酸峰面積的RSD為2.02%，甘松新酮峰面積的RSD為2.18%。結(jié)果表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

綠原酸、甘松新酮的平均回收率分別為99.2%，101.1%，RSD分別為1.73%，1.10%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 樣品中綠原酸、甘松新酮的含量測(cè)定

按照“1.2.9”方法測(cè)定樣品中綠原酸、甘松新酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，綠原酸含量在0.026%～0.355%，甘松新酮的含量在0.109%～2.013%。

表2 不同產(chǎn)地甘松藥材中綠原酸、甘松新酮的含量(n=2)

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)以綠原酸和甘松新酮為指標(biāo)性成分，分別以甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇作為提取溶劑，采用超聲提取法和加熱回流提取方法提取，并對(duì)提取時(shí)間(30min，1h)和提取次數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，超聲提取法甘松新酮的含量明顯高于加熱回流法，兩種方法提取的綠原酸含量并無(wú)明顯差異。超聲法操作簡(jiǎn)單，快速，故提取方法確定為樣品加入甲醇100mL超聲提取1h，提取2次。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)綠原酸和甘松新酮兩個(gè)對(duì)照品的甲醇溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描波譜顯示綠原酸最大吸收波長(zhǎng)為330nm，甘松新酮最大吸收波長(zhǎng)為254nm，為使兩種成分在同一波長(zhǎng)下均有吸收，故本文選擇274nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)以甲醇-水為流動(dòng)相，存在拖尾現(xiàn)象，因此在流動(dòng)相加磷酸以改善拖尾現(xiàn)象，在此基礎(chǔ)上比較了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水等洗脫溶劑，并比較了流速分別為0.8mL/min和1.0mL/min時(shí)兩種化合物的分離度，最終確定了流速為1.0mL/min時(shí)，兩種成分與雜質(zhì)峰分離度良好的乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)建立了甘松中綠原酸和甘松新酮的含量的測(cè)定的分析方法，并采用此方法對(duì)25個(gè)產(chǎn)地的甘松藥材進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果表明，綠原酸含量在0.026%～0.355%，甘松新酮的含量在0.109%～2.013%。由此可見(jiàn)，不同產(chǎn)地的甘松藥材含量差異較大，四川紅原縣的甘松新酮的含量高達(dá)2.013%，四川松潘縣山巴鄉(xiāng)的甘松中綠原酸含量高達(dá)0.355%，甘肅4個(gè)產(chǎn)地的甘松藥材中兩種成分的含量均較高，四川不同產(chǎn)區(qū)的甘松藥材含量有較大差異，可能是受生長(zhǎng)的土壤、生長(zhǎng)年限、采收季節(jié)和貯存時(shí)間等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相法對(duì)不同產(chǎn)地的甘松藥材中綠原酸、甘松新酮的含量進(jìn)行比較分析，為甘松藥材的質(zhì)量控制規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化提供參考依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:79-80.

［2］萬(wàn)新，石晉麗，劉勇，等.甘松屬植物化學(xué)成分與藥理作用［J］.國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè))，2007，22(1):1-6.

［3］Surendra Kumar Sharma，Ajay Pal Singh.In Vitro Antioxidant and Free Radical Scavenging activity of Nardostachys jatamansi DC［J］.Journal of Acupuncture and Meridian Studies，2012，5(3):112-118.

［4］李琴.甘松新酮抗抑郁作用以及作用機(jī)制初探［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

［5］武姣姣，石晉麗，唐民科，等.甘松對(duì)動(dòng)物行為絕望模型的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(7):205-207.

［6］Liu Jian-hui，Yin Fei，Zheng Xu-xu.Nardostachys chinensis Glycoside Induces Characteristics of Neuronal differentiation in Rat Pheochromocytoma PC12 Cells［J］.Biol Pharm Bull，2005，28(4):768-771.

［7］Li Ping，Kimihiro Matsunaga.Nardosinone，the firstenhancer of neurite outgrowth-promoting activity of staurosporine and dibutyryl cyclic AMP in PC12D cells［J］.Developmental Brain Research，2003，1(45):177-183.

［8］李瑋，石晉麗，李琴，等.甘松新酮對(duì)缺糖缺氧損傷原代培養(yǎng)神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(9):1422-1429.

［9］張盼，程光宇，程為平.淺談甘松的臨床應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015，43(2):99-100.

［10］劉穎，郭明曄.綠原酸的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2012，35(7):1180-1185.

［11］何躍，楊松濤，唐建軍，等.甘松不同提取成分組合給藥預(yù)防大鼠急性胃炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2011，8(1):27-29.