董坤，寇韓旭，寧馨，孫超，馬英麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

蓬子菜(Galium verum L.)為茜草科(Rubiaceae)拉拉藤屬(Galium)藥用植物。實(shí)驗(yàn)證明，蓬子菜中化學(xué)成分主要為黃酮、蒽醌及環(huán)烯醚萜類，其中黃酮類成分是其治療周圍血管病(靜脈、動(dòng)脈及淋巴系統(tǒng)疾病)的有效部位，主要包括香葉木苷(Diosmin)、木犀草苷(Luteoloside)、蕓香苷(Rutin)等。據(jù)研究表明，蓬子菜治療靜脈系統(tǒng)疾病的活性成分主要為香葉木苷(Diosmin，3'，5，7-三羥基4'-甲氧基黃酮-7-蕓香苷)，具有改善微循環(huán)和抗炎的作用［1］。本實(shí)驗(yàn)以香葉木苷藥理作用和急性血瘀模型大鼠的病理表現(xiàn)為基礎(chǔ)，通過測定凝血四項(xiàng)指標(biāo)，證明香葉木苷具有抗凝血和改善纖溶系統(tǒng)功能的作用;同時(shí)，通過測定血液中相關(guān)細(xì)胞黏附因子的含量，證明香葉木苷具有改善血管內(nèi)皮功能的作用，為蓬子菜治療血瘀證的臨床使用提供藥效學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量200～300g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):SCXK2009-0002)。

1.2 藥品與試劑

香葉木苷(C28H32O15)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%(HPLC);阿司匹林泡騰片(阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)H32026199);鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)H12020526);水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130325);大鼠sICAM-1 ELISA試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)1406053);大鼠sVCAM-1 ELISA試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)1406091);凝血酶原時(shí)間測定試劑盒(Siemens Lot545570);活化部分凝血活酶時(shí)間測定試劑盒(Siemens Lot538084);凝血酶時(shí)間測定試劑盒(Siemens Lot504472);纖維蛋白原測定試劑盒(Siemens Lot546743)。

1.3 儀器

全自動(dòng)血液凝固儀(CA-7000，SYSMEX);離心機(jī)(KDC-160HR，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀(SpectraMax Plus384，Molecular Devices)。

2 方法

2.1 分組與給藥

Wistar大鼠，雄性，平均體質(zhì)量250g。隨機(jī)分成6組，每組10只。大鼠給藥劑量參考陳奇主編《藥理試驗(yàn)方法學(xué)》，按人的臨床給藥劑量進(jìn)行換算。實(shí)驗(yàn)分組如下:空白組與模型組:均灌胃與給藥組等體積生理鹽水;香葉木苷低劑量組:45mg/(kg·d);香葉木苷中劑量組:90mg/(kg·d);香葉木苷高劑量組:180mg/(kg·d);阿司匹林組:25mg/(kg·d)。各組均采用灌胃給藥，按劑量連續(xù)給藥14天。

2.2 造模方法

各組大鼠連續(xù)灌胃14天，于第13天給藥后，除空白組外，各組大鼠采用皮下注射，每只大鼠每次注射鹽酸腎上腺素0.8mg/kg，共2次，間隔4h。于第一次注射后2h時(shí)，將除空白組外其他組別的大鼠均置于0～2℃冰水中浸泡5min，制造大鼠急性血瘀模型。造模后，禁食不禁水。在禁食第12h后，于手術(shù)前30min時(shí)最后一次灌胃給藥。

2.3 取材方法

采用腹腔注射麻醉，麻醉劑為10%水合氯醛。將大鼠仰臥位固定，沿腹中線劍突以下切開皮膚3cm，進(jìn)行下腔靜脈采血，并于4h內(nèi)檢測凝血功能指標(biāo)。并將部分血液分別取血清、血漿分裝，貯存于-80℃冰箱，以用于檢測血液中細(xì)胞黏附因子的含量。

2.4 檢測方法

2.4.1 凝血功能檢測

將處理后的樣本及各種所需試劑放入血液凝固儀，檢測凝血四項(xiàng)。即PT(凝血酶原時(shí)間)、APTT(活化部分凝血活酶時(shí)間)、TT(凝血酶時(shí)間)、FIB(纖維蛋白原)。

2.4.2 細(xì)胞黏附因子sICAM-1、sVCAM-1檢測

采用ELISA法，檢測樣本中sICAM-1(可溶性細(xì)胞間黏附因子-1)、sVCAM-1(可溶性血管細(xì)胞黏附因子-1)含量，所有操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 香葉木苷對急性血瘀模型大鼠凝血功能的影響

由表1可知，與空白組比較，模型組PT、APTT、TT時(shí)間縮短，F(xiàn)IB值升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明在造模過程中，血瘀大鼠的凝血功能明顯發(fā)生異常。PT:與模型組相比，香葉木苷各劑量組的PT時(shí)間均有不同程度延長，其中低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，中劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而高劑量組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。APTT:與模型組相比，香葉木苷各劑量組APTT時(shí)間均延長，其中低、高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而中劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TT:與模型組相比，香葉木苷各劑量組均能延長TT時(shí)間，其中低、中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FIB:與模型組相比，香葉木苷各劑量組FIB值降低，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

蓬子菜中香葉木苷對急性血瘀模型大鼠PT時(shí)間的延長，表明香葉木苷能抑制外源性凝血途徑;對APTT時(shí)間的延長，表明香葉木苷有抑制內(nèi)源性凝血途徑的作用;對FIB值的降低，表明香葉木苷能有效降低血漿纖維蛋白原含量，促進(jìn)纖溶活性;對TT時(shí)間的延長，表明香葉木苷能延長纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的時(shí)間，減慢纖維蛋白形成速度，抑制血液凝固。

表1 香葉木苷對大鼠凝血功能的影響()

表1 香葉木苷對大鼠凝血功能的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;與空白組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別 劑量(mg/kg) PT(s) APTT(s) FIB(g/L) TT(s)空白組 - 10.82±0.21＊＊ 23.82±0.59＊＊ 2.96±0.02＊＊ 46.66±1.44＊＊模型組 - 9.62±0.35△△ 17.34±1.66△△ 4.79±0.07△△ 41.35±0.13△△低劑量組 45 11.23±0.71＊＊ 20.23±0.33* 3.78±0.09＊＊ 45.40±0.52＊＊中劑量組 90 11.75±1.35* 22.45±1.80＊＊ 3.84±0.42＊＊ 47.50±1.65＊＊高劑量組 180 9.89±0.27 19.31±0.83* 3.62±0.22＊＊ 42.00±1.55阿司匹林組 25 12.18±0.35＊＊ 19.26±1.79 4.11±0.16＊＊42.16±1.25

3.2 香葉木苷對細(xì)胞黏附因子sICAM-1、sVCAM-1的影響

由表2可知，與空白組相比，模型組所釋放的sICAM-1和sVCAM-1含量增多，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明在急性血瘀造模過程中，血管內(nèi)皮受損，血液中黏附因子表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞黏附白細(xì)胞能力增強(qiáng)，引起炎癥發(fā)生，促進(jìn)血液高凝狀態(tài)，導(dǎo)致血瘀發(fā)生。

sICAM-1:與模型組相比，香葉木苷各劑量組能明顯降低sICAM-1的含量，其低劑量組較之模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，中、高劑量組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

sVCAM-1:與模型組相比，香葉木苷各劑量組均可有效降低sVCAM-1的含量，且各組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

蓬子菜中香葉木苷能改善白細(xì)胞的流變性，抑制白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附，從而抑制炎癥的發(fā)生，改善血瘀癥狀。

表2 香葉木苷對大鼠sICAM-1和sVCAM-1的影響()

表2 香葉木苷對大鼠sICAM-1和sVCAM-1的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;與空白組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別 劑量(mg/kg)sICAM-1(ng/ml)sVCAM-1(ng/ml)空白組 - 13.07±3.60* 49.00±34.41*模型組 - 17.34±4.41△ 90.37±39.32△低劑量組 45 10.23±6.28* 32.84±25.29＊＊中劑量組 90 9.39±5.89＊＊ 35.72±30.31＊＊高劑量組 180 10.25±5.24＊＊ 27.07±11.48＊＊阿司匹林組 25 11.16±6.84* 26.14±6.96＊＊

4 討論

本實(shí)驗(yàn)所采用的血瘀造模方法，可導(dǎo)致健康動(dòng)物處于急性應(yīng)激狀態(tài)，從而造成血管內(nèi)皮受損，而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷正是血管病變的始因之一。相對的，血管內(nèi)皮功能失調(diào)可進(jìn)一步促發(fā)血瘀證。

血瘀證可由多種因素引起，并不同程度造成血管內(nèi)皮損傷，引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，繼而釋放黏附因子ICAM-1、VCAM-1等，介導(dǎo)血管內(nèi)皮與白細(xì)胞黏附得更加緊密和穩(wěn)定，并逐漸改變內(nèi)皮細(xì)胞骨架形態(tài)，引發(fā)并擴(kuò)大血管局部炎癥［2］。血管內(nèi)皮功能異常導(dǎo)致黏附分子ICAM-1、VCAM-1等從內(nèi)皮表面脫落，以可溶形式sICAM-1、sVCAM-1等存在于血液中，可作為血管內(nèi)皮損傷的早期標(biāo)志物。

當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，暴露內(nèi)膜下蛋白基層，激活血小板，而在活化的血小板膜上則暴露出FIB的結(jié)合位點(diǎn)，黏附血漿中游離的纖維蛋白原，以它為連接橋梁，導(dǎo)致血小板聚集［3］，促進(jìn)凝血酶生成，加快凝血速度，并激活內(nèi)外源凝血系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香葉木苷可改善血管內(nèi)皮功能。血管內(nèi)皮損傷參與了血瘀證的發(fā)生與發(fā)展過程，是血瘀證產(chǎn)生的重要基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞受損后，刺激血小板釋放凝血酶，導(dǎo)致大量的ICAM-1、VCAM-1釋放，促使內(nèi)皮細(xì)胞黏附白細(xì)胞的能力增強(qiáng)，故血液中sICAM-1和sVCAM-1的含量與內(nèi)皮細(xì)胞受損程度呈正相關(guān)［4］。香葉木苷能減少急性血瘀大鼠血管內(nèi)皮中的ICAM-1、VCAM-1的釋放，進(jìn)而下調(diào)血液中sICAM-1和sVCAM-1的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香葉木苷能明顯改善急性血瘀大鼠的凝血功能。凝血四項(xiàng)已被廣泛用于檢查凝血機(jī)制異常。PT反映外源性凝血因子含量，APTT反映內(nèi)源性凝血因子含量，香葉木苷能延長PT、APTT時(shí)間，通過抑制外源及內(nèi)源凝血途徑，抑制血瘀發(fā)展和血栓形成。TT反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的時(shí)間，香葉木苷能延長TT時(shí)間，增強(qiáng)纖溶活力，降低凝血因子活性。FIB即凝血因子I，是一種主要的凝血蛋白質(zhì)，香葉木苷能降低FIB含量，從而降低血液黏度，抑制血瘀的進(jìn)一步發(fā)展。

［1］蘇秀麗.香葉木苷調(diào)控血栓靶蛋白的研究［D］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2012.

［2］郭楊志.益氣化痰活血法對AS黏附分子的影響及其與血脂異常證候的相關(guān)性［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

［3］陳可冀，薛梅，殷惠軍.血小板活化與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和血瘀證的關(guān)系［J］.首都軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(3):267-269.

［4］柴欣樓，張永生，等.葛根素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-6及NO含量的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(8):546-549.