董 靜，劉 群

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是由低氧所誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，于1992 年由Semenza 和Wang 在研究缺氧誘導(dǎo)的EPO 基因時，從細(xì)胞核中提取發(fā)現(xiàn)，參與氧穩(wěn)態(tài)失衡調(diào)節(jié)的一個核轉(zhuǎn)錄因子［1］。HIF-1 的生理活性主要取決于HIF-1α 亞基的活性和表達(dá)［2］。HIF-1α 常氧條件下由于快速降解而無法檢測到，缺氧條件下，HIF-1α 與HIF-1β 形成有活性的HIF-1 二聚體，誘導(dǎo)其下游靶基因的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)一系列靶基因來調(diào)節(jié)血管舒張和新生血管生成、紅細(xì)胞生成和抗炎癥反應(yīng)，從而改善腦組織缺氧和損傷。近年來研究已證實，HIF-1α 在腦缺血的保護(hù)性反應(yīng)中起重要的作用，但有學(xué)者推測ICH 后，HIF-1α 的過量表達(dá)可能參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡等的病理過程，并加重了腦出血(ICH)后腦損傷的過程。近期有學(xué)者在動物研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 與ICH 后水腫密切相關(guān)。本研究采用人腦出血灶周組織，應(yīng)用免疫組化SP 法觀察血腫周邊神經(jīng)組織中HIF-1α 蛋白的表達(dá)情況，并探討腦水腫程度與HIF-1α 蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 一般資料 2013 年1 月～2013 年12 月在吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科收治的高血壓腦出血患者24 例，均行開顱經(jīng)顳葉入路血腫清除術(shù)。均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的ICH診斷標(biāo)準(zhǔn)，全部為基底節(jié)區(qū)出血。

1.2 標(biāo)本的抽取 全部患者在經(jīng)顳葉皮質(zhì)“造瘺”清除血腫時，將入路通道范圍內(nèi)緊鄰血腫的腦組織保存下來，做為病例組標(biāo)本，大小約0.1～0.15 mm3，病例組按發(fā)病時間分為＜6 h、6～24 h、24 h～3 d、＞3 d 組。將部分患者皮質(zhì)“造瘺”起始處即遠(yuǎn)離血腫2～3 cm 左右腦組織保留下來，做為對照組標(biāo)本，共6 例。將所取的腦組織分兩部分，一部分用液氮運送至-70 ℃冰箱凍存，一部分組織于10%福爾馬林固定液中浸泡固定后石蠟包埋。連續(xù)切片進(jìn)行HE 染色和HIF-1α 免疫組化染色。另取血腫周邊腦組織約100 mg 進(jìn)行腦組織含水量測定。

1.3 HIF-1α 免疫組化SP 法檢測 鼠抗人HIF-1α 多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAB 顯色試劑盒、SP-9710 試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)限公司。免疫組化過程按試劑盒說明進(jìn)行，以PBS 代替一抗作陰性對照。免疫組化染色細(xì)胞質(zhì)陽性為棕黃色結(jié)果，胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，紅細(xì)胞呈桔紅色，其它成分呈深淺不同紅色。數(shù)碼相機拍照，在血腫周圍和對照組隨機各取5 個視野，圖像采用Motic Images advanced 3.2 彩色圖像分析系統(tǒng)，所測得的灰度值越大陽性越弱，灰度值越小陽性越強。

1.4 RT-PCR 方法檢測HIF-1αmRNA 定量Rtizol 裂解細(xì)胞后抽提總RNA，取1 ml 測光密度值，DNA 消化。使用日本Toyobo 公司試劑盒逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行cDNA 合成.引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，序列如下:HIF-1α 上游:CCTATGTAGTTGTGGAAGTTTATGC;HIF-1α 下 游:ACTAGGCAATTTTGCTAAGAATG。PCR 體系:cDNA:2 μl，Taq 酶0.25 μl，總反應(yīng)體系:25 μl。PCR循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性，2 min，94 ℃變性，30 s，30 次循環(huán)，55 ℃退火，30 s，30 次循環(huán)，72 ℃延伸，1 min，30 次循環(huán)。反應(yīng)后將制備好的cDNA 放-20 ℃冷凍保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，記錄結(jié)果。產(chǎn)物定量分析:利用ABI PRISM 7700 Sequence Detector，臨測每個循環(huán)的熒光強度，通過Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。

1.5 腦組織含水量測定 采用干濕重法測定腦組織含水量，取腦組織約150 mg，電子天平稱濕重后置于100 ℃烤箱烘烤24 h 至恒重，稱取干重。計算公式:按Blliot 公式腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，精確度為0.11 mg。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測HIF-1α HIF-1α 主要在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞核中表達(dá)，其中胞核染色陽性的細(xì)胞多聚集在靠近血腫邊緣的壞死區(qū)及血管相對稀少的區(qū)域，胞質(zhì)中也有表達(dá)，DAB 染色成棕褐色(見圖1、圖2)。對照組及出血灶周人腦組織中HIF-1α 的灰度值測定(見表1)，對照組與6 h 組相比無差異(P ＞0.05)，對照組與出血組各組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，且出血組各組之間亦有差異(P ＜0.05)。在出血6 h 后，HIF-1α 的陽性細(xì)胞增加，灰度值減少，24 h～3 d 陽性細(xì)胞數(shù)最多，灰度值最低，之后逐漸上升。

圖1 6～24 h 組HIF-1α 陽性表達(dá)細(xì)胞(SP×400)

圖2 24 h～3 d HIF-1α 陽性表達(dá)細(xì)胞(SP×400)

表1 各組HIF-1α 灰度值的比較(，n=5)

表1 各組HIF-1α 灰度值的比較(，n=5)

與對照組相比，aP ＞0.05;與＜6 h 組比較，bP ＜0.05;與6～24 h 組比較，cP ＜0.05;與24 h～3 d 組比較，dP ＜0.05

表2 ICH 后HIF-1α mRNA 表達(dá)()

表2 ICH 后HIF-1α mRNA 表達(dá)()

與對照組比較* P ＜0.05

表3 各組腦組織含水量的比較

2.2 RT-PCR 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，在近145bp 處出現(xiàn)HIF-1α mRNA 表達(dá)產(chǎn)物，分別于各時間點觀察對照組及出血組HIF-1α mRNA 的表達(dá)，HIF-1α 的PCR 產(chǎn)物相對定量分析結(jié)果(見表2、圖3)，結(jié)果可見對照組中有少量表達(dá)，血腫灶周6 h 出現(xiàn)HIF-1α陽性細(xì)胞，24 h 進(jìn)一步增加，24 h～3 d 時HIF-1α 陽性細(xì)胞表達(dá)達(dá)高峰，3 d 后仍可見HIF-1α 的表達(dá)，但較3 d 時下降(兩組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.05)。

2.3 ICH 后腦組織含水量變化 見表3，在出血6 h 內(nèi)含水量即開始增高，24 h 后較明顯增高，3 d左右達(dá)到峰值，之后減輕(P ＜0.05)。

2.4 ICH 組HIF-1α 灰度值與腦組織水含量關(guān)系 用直線回歸進(jìn)行分析顯示(見圖4):ICH 后各時間點HHIF-1α 灰度值與腦組織水含量的變化呈負(fù)的直線相關(guān)關(guān)系(r=-0.85849，P ＜0.001)，24 h～3 d 顯著降低(P ＜0.05);3 d 達(dá)到最低;HIF-1α 含量與腦組織含水量均表現(xiàn)出一致的時相依賴性變化，即隨著HIF-1α 表達(dá)的增加腦組織水含量也增加，且相關(guān)關(guān)系非常密切。

圖3 HIF-1α 的PCR 產(chǎn)物相對定量分析

圖4 出血灶周腦組織含水量與HIF-1α 灰度值表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn):HIF-1α 在ICH 出血灶邊緣及壞死區(qū)均有明顯表達(dá)，主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞核，胞質(zhì)中也有表達(dá)，這和國外一些學(xué)者的研究結(jié)果基本一致［3］，且隨著出血時間的延長，HIF-1α 表達(dá)的陽性率及表達(dá)強度也逐漸增加，3 d 達(dá)高峰，后逐漸下降，出血后不同時間點陽性表達(dá)率比較(P ＜0.05)，有顯著性差異，提示HIF-1α 的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧的時間密切相關(guān)［4，5］。腦組織缺血、缺氧均可誘導(dǎo)ICH周圍缺血區(qū)HIF-1α 表達(dá)增加［6］。

近二十余年來，動物實驗已經(jīng)證實，ICH 后血腫形成分泌的凝血酶可導(dǎo)致ICH 后腦水腫的形成和神經(jīng)功能的損傷［7］。1999 年，Xi 等［8］在實驗中再一次證實凝血酶可導(dǎo)致ICH 后大鼠腦組織水腫。綜上所述，現(xiàn)已達(dá)成專家共識。凝血酶本身是引起ICH 早期腦水腫的重要因素。近年來，有學(xué)者證明在ICH過程中，凝血酶大量釋放，能刺激HIF-1α 蛋白的表達(dá)［9］。Richard 等［10］在體外平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在正常氧分壓下，凝血酶可以上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。凝血酶導(dǎo)致ICH 后腦水腫的病理生理機制較為復(fù)雜，目前已進(jìn)行了一些相關(guān)動物實驗研究，提出凝血酶對BBB 的破壞和對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用可能是ICH 后腦水腫形成的重要機制，也有動物實驗表明，凝血酶及HIF-1α 共同參與ICH 后腦水腫的形成。

以往的研究表明，ICH 6 h 后，血腫周圍開始出現(xiàn)水腫，24 h～3 d 內(nèi)腦水腫的程度加重，一般認(rèn)為，ICH 后3 d 水腫程度達(dá)到高峰。我們在實驗中也觀察到，HIF-1αmRNA 在ICH 后3 d 陽性表達(dá)，顯著高于其它時間點。而且我們經(jīng)過對ICH 后不同時間HIF-1α 表達(dá)的情況與腦水腫的程度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示HIF-1α 的表達(dá)與腦水腫的程度成正相關(guān)。國內(nèi)個別研究有類似發(fā)現(xiàn)［11］，HIF-1α 表達(dá)主要位于出血血腫壞死邊緣區(qū)域的腦組織，24 h 后HIF-1α 陽性表達(dá)率為94.4%，明顯高于其它時間，提示HIF-1α 的表達(dá)與腦組織水腫程度關(guān)系密切。ROS已被證實與腦組織受損后神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生水腫有直接關(guān)系，因而HIF-1α 表達(dá)增加的情況與腦水腫的程度有相關(guān)性可能與此機制有關(guān)。

一般認(rèn)為低氧環(huán)境是誘導(dǎo)HIF-1α 表達(dá)增強的一個重要因素［12］。在常氧條件下，細(xì)胞漿內(nèi)HIF-1α的表達(dá)水平很低，但在低氧條件下，HIF-1α 卻大量集聚并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中。我們的實驗也證實ICH 后HIF-1α 主要表達(dá)于灶周神經(jīng)細(xì)胞胞核，染色陽性的細(xì)胞多聚集在靠近血腫邊緣的壞死區(qū)及血管相對稀少的區(qū)域，和國內(nèi)某些研究一致。本實驗研究結(jié)果顯示:ICH 后采用RT-PCR 法能明顯的檢測到HIF-1α 的表達(dá)，而對照組未見HIF-1α 蛋白信號，提示在ICH 過程中，存在其他調(diào)節(jié)HIF-1α 表達(dá)的因素，低氧可能并非誘導(dǎo)HIF-1α 蛋白表達(dá)增強的唯一機制。

據(jù)近年的研究，認(rèn)為HIF-1α 對出血性卒中有一定的保護(hù)作用。HIF-1α 激活轉(zhuǎn)錄多種靶基因，增加缺氧組織的氧氣供應(yīng)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對機體形成保護(hù)作用。ICH 后，HIF-1α 可以通過靶基因促進(jìn)VEGF 表達(dá)，促使新生血管生成［13，14］，改善腦血流動力學(xué)，使腦缺血得以迅速恢復(fù)，保護(hù)腦細(xì)胞。ICH后，出血灶周邊腦組織處于持續(xù)的缺血缺氧狀態(tài)，而缺氧可使多種基因差異表達(dá)，引起相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子變化的連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致腦水腫，顱內(nèi)壓增高且啟動腦組織細(xì)胞的抗損傷和修復(fù)反應(yīng)［15］。HIF-1α 是缺氧狀態(tài)下血管生成的核心調(diào)控因子，通過影響其他生長因子的表達(dá)，而直接參與血管生成的全過程［16，17］，在這一過程中因?qū)θ毖醯倪m應(yīng)性可能是腦組織抗損傷和修復(fù)的關(guān)鍵。而細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)性主要靠HIF-1α 調(diào)節(jié)［18］，它能減少細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)目有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

Papandreou 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，低氧時HIF-1α 可通過誘導(dǎo)丙酮酸脫氫酶激酶-1 的表達(dá)，使得細(xì)胞內(nèi)氧張力增高，改善ICH 后的能量供應(yīng)，腦損傷減輕。另外，Helton 等［20］通過敲除大鼠大腦HIF-1α 基因發(fā)現(xiàn)，不僅未增加腦缺氧缺血損傷，反而減輕了缺氧缺血后腦損傷，這一結(jié)果使我們對HIF-1α 的腦保護(hù)作用仍有待進(jìn)一步探討。普遍認(rèn)為，輕度缺氧時，HIF-1α 產(chǎn)生缺氧耐受性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;長期重度缺氧時，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)毒性作用［21，22］。實驗表明［23］嚴(yán)重長時間缺氧能使HIF-1α去磷酸化，去磷酸化的HIF-1α 導(dǎo)致p53 穩(wěn)定性增加，介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜上可見，HIF-lα 具有雙重調(diào)節(jié)作用，在不同的缺氧狀態(tài)、對細(xì)胞發(fā)揮著保護(hù)或促凋亡的作用，兩者誰占主導(dǎo)與缺氧嚴(yán)重程度有關(guān)［24］。

目前HIF-1α 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究正在成為熱點，HIF-1α 在ICH 中所發(fā)揮的作用，是繼發(fā)性缺血損傷還是誘導(dǎo)血管新生來促進(jìn)缺血周邊組織的側(cè)枝循環(huán)以改善供血，在ICH 時如何調(diào)控HIF-1α 的表達(dá)值得今后研究。

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