吳浩浪，陳晉廣

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院，中山 528415；2.廣東省中山市人民醫(yī)院，中山 528403）

近年來隨著對Th17 細(xì)胞研究的深入，Th17/Treg 細(xì)胞在多種自身免疫性疾病中的發(fā)病作用成為研究熱點,改變了以往對某些自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。早期Kunihara 等[1]研究報道，Th17、Treg 異常表達(dá)在RA、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等多種炎性關(guān)節(jié)病中起到重要作用, 而且與患者病情等緊密相關(guān)。筆者通過對老年患者銀屑病性關(guān)節(jié)炎Th17、Treg 細(xì)胞表達(dá)及相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17（IL-17）、血清人轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）水平進(jìn)行檢測,探討在銀屑病性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 近5 年來本院風(fēng)濕免疫科、皮膚科的銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者36 例。其中男19 例,女17例，年齡59～78 歲,病程3 年～16.5 年。所有研究對象均無心腦血管、肝、腎、內(nèi)分泌等其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病，同時近半個月未應(yīng)用過免疫調(diào)節(jié)劑及糖皮質(zhì)激素等藥物系統(tǒng)治療。30 例正常對照組來自病人家屬或陪護(hù)人，其中男18 例,女12 例，年齡61～75 歲，均無嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病及其他自身免疫病。2 組研究對象的性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究對象簽訂知情同意書。

1.2 IL-17、TGF-β1 檢測 清晨抽取空腹外周靜脈血5 mL 肝素抗凝，ELISA 法（ELISA 試劑盒，美國R＆D 公司）檢測TGF-β1、IL-17 表達(dá)水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3 個復(fù)孔,在波長為450 nm 下用酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.3 Th17 和CD4+CD25+Treg 亞群檢測 空腹抽取外周靜脈血5 mL，F(xiàn)icoll 密度梯度法分離淋巴細(xì)胞，PBS 沖洗（含1%小牛血清）,制備淋巴細(xì)胞懸液（濃度1×109/L）,48 孔培養(yǎng)板,每孔1 mL,加50 μg/L 佛波酯、1 mg/L 離子霉素和2 μmol/L 莫能菌素, 在孵箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞分為對照管和實驗管, 加入20 μL 鼠抗人CD4 單抗（PE-Cy5 標(biāo)記，美國R＆D 公司），混勻,避光放置20 min（室溫）對表面抗原染色。加Cytofix/Cytoperm 液200 μL，放置20 min（4 ℃）,通透和固定細(xì)胞,洗滌。實驗管加入鼠抗人CD25 抗體（FITC 標(biāo)記）和IL-17 抗體（FITC標(biāo)記）各10 μL，對照管加入同型對照抗體,避光孵育30 min（4 ℃）,用Perm/Wash 液1 mL 洗滌2 次,以300 μL 洗滌液重懸細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測。以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th 細(xì)胞（CD4+）,以散點圖IL-17、CD25陽性表示Th17和Treg,Cellsquest 軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

Th17 細(xì)胞在銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者外周血中表達(dá)顯著高于對照組（u=3.60，P＜0.05），2 組Treg 細(xì)胞的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（u=0.98，P＞0.05）；銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者Th17/Treg 也顯著高于對照組（u=4.07，P＜0.05）。IL-17 在銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者外周血中水平高于對照組（t=3.41，P＜0.05），TGF-β1 表達(dá)水平顯著低于對照組（t=4.40，P＜0.05）。見表1。

表1 2 組Th17/Treg、IL-17、TGF-β1 表達(dá)比較 （±s）

表1 2 組Th17/Treg、IL-17、TGF-β1 表達(dá)比較 （±s）

TGF-β1（pg/mL）銀屑病性關(guān)節(jié)炎組組別 n Th17（%）Treg（%）Th17/Treg IL-17（pg/mL）36 15.40±1.70 6.10±1.22 3.01±0.50 421.44±151.10 179.41±98.20對照組 30 8.42±1.37 5.91±1.20 1.81±0.17 251.67±119.24 231.47±109.91

3 討論

銀屑病性關(guān)節(jié)炎是一種累及多關(guān)節(jié)和結(jié)締組織的慢性炎癥性、免疫性疾病，研究顯示，高達(dá)40%～57%患者有破壞性畸形關(guān)節(jié)炎，17%患者可出現(xiàn)5個或更多關(guān)節(jié)畸形，11%～19%導(dǎo)致殘疾[2]，嚴(yán)重影響患者的健康。Treg、Th17 分化失衡參與了多種炎癥反應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病發(fā)病[3]。Kunihara 等[1]研究報道，Th17/Treg 細(xì)胞亞群失衡參與了RA、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等多種炎性關(guān)節(jié)病的發(fā)病，與病情活動度相關(guān)。銀屑病是一種T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)并維持的累及皮膚及關(guān)節(jié)損害的自身免疫性疾病，亦存在Th17的異?；罨痆4]。Treg 可通過抑制性細(xì)胞因子TGF-β1、細(xì)胞接觸機(jī)制等發(fā)揮主動免疫抑制效應(yīng)，可選擇性抑制某些效應(yīng)性T 細(xì)胞和某些自身反應(yīng)性T 細(xì)胞活化，在機(jī)體免疫耐受的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[5]。

本研究顯示，Th17 細(xì)胞在PsA 患者外周血中表達(dá)明顯高于正常人群（P＜0.05），而Treg 表達(dá)無顯著性變化（P＞0.05）；從而導(dǎo)致患者Th17/Treg 升高現(xiàn)象。除了分泌IL-17 外，Th17 細(xì)胞還可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生IL-6，IL-6 轉(zhuǎn)而又能劑量依賴性促進(jìn)IL-17 的分泌,這種正反饋作用進(jìn)一步促進(jìn)患者IL-17 高表達(dá)。當(dāng)機(jī)體TGF-β1水平低下時，初始型T 細(xì)胞向Treg 的分化將減弱，Treg 不能隨Th17 升高而相應(yīng)上升，從而出現(xiàn)Th17/Treg 失調(diào)。Th17 表達(dá)的破骨細(xì)胞分化因子與破骨細(xì)胞前體上的NF-κB 的受體激活劑結(jié)合，導(dǎo)致破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞[6]。TGF-β1 在骨髓成骨祖細(xì)胞分化、增殖中起到重要作用，銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者TGF-β1 表達(dá)降低勢必影響病人骨形成以及骨關(guān)節(jié)修復(fù)，與楊雁等[7]研究結(jié)論一致。Th17/Treg 的漂移以及相關(guān)細(xì)胞因子的變化反映了銀屑病性關(guān)節(jié)炎整個復(fù)雜免疫反應(yīng)異常的又一個重要環(huán)節(jié),為今后銀屑病性關(guān)節(jié)炎免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。

[1] Kunihara T, Sasaki S, Nishibe T, et al. Successful endovascular stent -grafting for thoracic aortic aneurysms in systemic lupus erithematosus. Report of 2 cases and review of the literature[J]. J Cardiovasc Surg（Torino）,2002,43:235-240.

[2] 吳東海，王國春．實用臨床風(fēng)濕病學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2001：306．

[3] Nakatsukasa H, Tsukimoto M, Tokunaga A, et al. Repeated gamma irradiation attenuates collagen-induced arthritis via up-regulation of regulatory T cells but not by damaging lymphocytes directly[J].Radiat Res,2010,174:313-324.

[4] 陳晉廣，楊志波.“血分論治”治療尋常性銀屑病患者外周血IL-17 和IL-23 的變化[J].中華皮膚科雜志,2012,45（2）:140-141.

[5] Zhan F,Wu HF,Wu J,et al.Immunology mechanism of CD4+CD25+Tregulatory cells acting on effect on T cells[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2004,18（4）:178-182.

[6] Sato K, Suematsu A, Okamoto K, et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction[J].J Exp Med,2006,203:2 673-2 682．

[7] 楊雁,楊靜,段西凌,等.銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的檢測[J].中華皮膚科雜志,2011,44（7）:513-514.