王歲樓，王海翔，楊志萍，吳曉宗

(中國藥科大學食品科學與安全系，南京 211198)

以β-胡蘿卜素為代表的類胡蘿卜素具有抗氧化、抗腫瘤等許多重要的生理功能，在食品、藥品及保健食品等領(lǐng)域用途廣泛。利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)天然類胡蘿卜素具有營養(yǎng)要求簡單、培養(yǎng)周期短、菌體可綜合利用等許多優(yōu)點，但目前菌種發(fā)酵產(chǎn)率相對較低［1］。超高壓處理是一種非常有希望的食品工業(yè)高新技術(shù)，它不僅被用于食品殺菌保藏和品質(zhì)改良，近年來也被用于食品發(fā)酵工業(yè)微生物的誘變育種［2］。本研究通過超高壓技術(shù)誘變獲得了類胡蘿卜素產(chǎn)量大幅度提高的紅酵母突變體［3，4］，并對其類胡蘿卜素的提取分離方法及光熱穩(wěn)定性和抗氧化活性等進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌種:酵母突變體，本實驗室保藏，系超高壓誘變獲得。

培養(yǎng)基(每1 000 mL):瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母膏10 g、瓊脂20 g，pH 值6.0;種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母膏10 g，自然pH;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖25 g、酵母膏3 g、硫酸銨5 g、番茄汁2.5 mL、花生油0.5 mL，pH 值6.0。

1.2 類胡蘿卜素提取分離和分析

發(fā)酵液離心獲得酵母菌體，用蒸餾水洗滌，在70℃干燥至恒重。根據(jù)前期研究經(jīng)驗篩選了酸-熱法、甲苯法、酶解法、自溶法和機械法5 種細胞破壁方法［5］，并以丙酮為有機溶劑從細胞碎片中浸提類胡蘿卜素色素，直到菌體顏色消退。將提取液離心分離，上清液用濾膜過濾。

上述類胡蘿卜素粗提液通過硅膠柱色譜做進一步分離純化后，采用薄層層析法(TLC)、紫外光譜法和HPLC 法進行定量定性分析，具體方法參考文獻［6，7］，結(jié)合實際略有改動。

1.3 穩(wěn)定性和抗氧化性評價

按照文獻［8］和［9］介紹的方法進行，略有改動。色素提取物的光、熱穩(wěn)定性通過比色法測定;體外抗氧化活性通過化學發(fā)光法測定，比較清除幾種自由基的IC50值，其IC50值越大，表明其清除氧自由基能力越弱。

2 結(jié)果與討論

2.1 從紅酵母突變體提取類胡蘿卜素

類胡蘿卜素是紅酵母的胞內(nèi)產(chǎn)物，必須先進行破壁處理。表1 是采用不同破壁方法提取類胡蘿卜素的產(chǎn)率，可見酸-熱法是其中最好的。其機制可能主要是由于鹽酸對細胞壁中原本結(jié)合緊密的多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)具有強大的疏松作用，并結(jié)合沸水浴和速冷處理，使細胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，細胞內(nèi)物質(zhì)溶出。

表1 不同破壁方法類胡蘿卜素產(chǎn)率

進一步根據(jù)L9(34)正交試驗設(shè)計，獲得了酸-熱法破壁的最佳組合條件為:鹽酸濃度2 mol/L，鹽酸用量12 mL/g 細胞，鹽酸浸泡時間40 min，沸水浴處理4 min。另一項研究表明，類胡蘿卜素最佳提取溶劑為丙酮，其最佳用量為20 mL/g 干細胞。在以上確定的最優(yōu)條件組合下，平均類胡蘿卜素提取率可達718.1 μg/g 干細胞(表2)。

表2 最適破壁和浸提條件下類胡蘿卜素提取結(jié)果

粗提物經(jīng)柱分離純化后，用TLC、紫外光譜和HPLC 進行分析，結(jié)果表明，該突變體酵母類胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)物中可能含有β-胡蘿卜素，還可能含有園酵母素、紅酵母紅素及其他不常見的類胡蘿卜素類物質(zhì)(表3、表4)，而這些類胡蘿卜素的抗氧化、抗腫瘤活性目前還很少見文獻報道，因此值得進一步深入研究。

表3 薄層色譜和紫外光譜試驗結(jié)果

表4 3 種類胡蘿卜素標準混合物的HPLC 特性

2.2 類胡蘿卜素提取物的光熱穩(wěn)定性及抗氧化活性

天然色素一般穩(wěn)定性較差，嚴重制約了其實際應(yīng)用。從表5、表6 可以看出，該類胡蘿卜素提取物對光和熱的穩(wěn)定性好于以前報道的類似色素，這表明該酵母突變體的類胡蘿卜素有很大的實用價值，但超高壓處理后酵母色素光熱穩(wěn)定性改善的原因有待今后研究。

類胡蘿卜素抗氧化活性是其最重要的功能特性，進行抗氧化作用研究是類胡蘿卜素應(yīng)用的基礎(chǔ)。不同的類胡蘿卜素其抗氧化活性不同，即使相同類胡蘿卜素其來源不同，抗氧化活性也可能不同。從表7 可見，該色素提取物對3 種主要類型的氧自由基均有不同程度的清除作用，其中對·O-2 的清除能力最強，清除·OH 的能力次之，清除H2O2能力最弱。

表5 不同光源和照射時間對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響(OD475)

表6 不同溫度和加熱時間對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響(OD475)

表7 類胡蘿卜素對3 種自由基的清除能力

3 結(jié)論

采用酸-熱法破壁和丙酮為浸提溶劑，從紅酵母超高壓突變株提取類胡蘿卜素是可行的。色素提取物經(jīng)過初步分離純化后，采用薄層色譜、紫外光譜和高效液相色譜進行分析，發(fā)現(xiàn)該色素提取物可能至少含有3 種類胡蘿卜素成分，包括β-胡蘿卜素、園酵母素及紅酵母紅素。穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，該色素光熱穩(wěn)定性良好，從體外自由基清除實驗也可看出，色素提取物具有良好的抗氧化活性，因此值得進一步開發(fā)研究。

［1］王歲樓，步芬.紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(12):250-254.

［2］王歲樓，王海翔.利用超高壓選育食品與發(fā)酵微生物的研究進展［J］.食品科學，2011，32(3):277-280.

［3］Wang SL，Sun JS，Han BZ.Optimization of β-carotene production by Rhodotorula glutinis using high hydrostatic pressure and response surface methodology ［J］.Journal of Food Science，2007，72(8):325-329.

［4］Wang SL，Chen DJ，Deng BW.Effects of high hydrostatic pressure on the growth and its β-carotene production of Rhodotorula glutinis ［J］.Yeast，2008，25(4):251-257.

［5］王歲樓，張鑫，張平之.紅酵母類胡蘿卜素的提取［J］.食品與機械，2000，6:30-31.

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［7］Bhosale PB.Studies on yeast Rhodotorula，its carotenoids and their applications ［D］.Pune:University OF Pune，2001.

［8］粟敏，謝達平，李帥.紅酵母色素的穩(wěn)定性和抗氧化性研究［J］.中國食物與營養(yǎng)，2008，7:25-28.

［9］王偉霞，李福后.紅酵母RY-8 菌株類胡蘿卜素與SOD 的純化及部分性質(zhì)［J］.食品科技，2009，34(8):19-22.