李相成，劉小紅，高 華，范美玲，劉 坤，王 威（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266021）

高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂或（和）尿酸排泄減少所引起的一組異質(zhì)性疾病，是引發(fā)痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)[1]。近年研究表明，高尿酸血癥與心血管疾病、慢性腎臟病及代謝綜合征，如糖尿病、肥胖等密切相關(guān)，是一種嚴重影響公共健康的疾病[2-4]。黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化生成尿酸，尿酸濃度過高會導(dǎo)致高尿酸血癥。黃嘌呤氧化酶作為尿酸生成的關(guān)鍵酶是降低尿酸藥物的作用靶點[5]。別嘌呤醇是在臨床上使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑，但有皮膚過敏、肝炎、超敏反應(yīng)綜合征等不良反應(yīng)，在一定程度上限制了其使用[6-8]。2008 年歐盟藥監(jiān)局和2009 年美國FDA 批準(zhǔn)上市的治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的新藥非布索坦（Febuxostat），是一種非嘌呤類黃嘌呤氧化酶抑制劑，其藥效優(yōu)于別嘌呤醇[9]，但最常見的副作用為肝功能異常、惡心、皮疹、關(guān)節(jié)痛等[10]。篩選抑制黃嘌呤氧化酶作用植物資源，系統(tǒng)研究其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，有望研制出高效、低毒、成分清楚、作用機制明確的組合物或先導(dǎo)化合物。

虎杖（Polygonum cuspidatumSielb.et Zucc.）為蓼科虎杖屬植物，其根莖和根入藥，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功能，臨床主要用于治療高脂血癥、肝炎、關(guān)節(jié)疾病等[11]。已有文獻報道虎杖提取物可降低高尿酸血癥模型動物血尿酸水平和抑制黃嘌呤氧化酶活性，可改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理改變[12]，但缺乏虎杖提取物對黃嘌呤氧化酶抑制活性物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制的系統(tǒng)深入的研究。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃嘌呤氧化酶-黃嘌呤反應(yīng)體系尿酸生成量，體外測定不同分離部位抑制作用，并進一步進行有效部位酶動力學(xué)抑制機制的探討，以為虎杖治療痛風(fēng)新藥開發(fā)和抑制黃嘌呤氧化酶作用有效成分研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；BT 125D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；HH420-2B 型精密恒溫水浴鍋（上海比朗儀器有限公司）；S25 型微型漩渦混合儀（德國IKA公司）。

1.2 藥材

虎杖藥材購于安徽省亳州市永剛飲片有限公司（批號：121221），經(jīng)大連大學(xué)馮寶民教授鑒定為真品。標(biāo)本存放于青島大學(xué)藥學(xué)院，樣品編號：QY-2012-PC-01。

1.3 試劑

黃嘌呤（批號：125K5302，純度：≥99%）、別嘌呤醇（批號：046K0668）、尿酸（批號：106K0690，純度：≥99%）、黃嘌呤氧化酶（批號：1001643586，質(zhì)量濃度：11 mg/ml，活性：0.3 U/mg）均購自美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 虎杖提取物的制備

取虎杖藥材1 kg加80%乙醇6 L回流提取2次，每次2 h，提取液合并，減壓回收乙醇得提取物282 g。取提取物250 g加水800 ml 使溶解，依次分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇振搖提取5 次，每次500 ml，減壓回收溶劑得虎杖石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物。

2.2 尿酸的測定[13]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：100 mmol/L 磷酸二氫鈉溶液（pH 3.5），流速：1.0 ml/min；檢測波長：90 nm；柱溫：25 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取尿酸對照品16.81 mg，置于250 ml 量瓶中，加水約150 ml，加0.01 mol/L 氫氧化鈉12.5 ml 使尿酸溶解，加水至刻度，搖勻；精密吸取10 ml，置于100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，制成尿酸質(zhì)量濃度為6.724 μg/ml的對照品溶液。

2.2.3 樣品測定 分別精密吸取供試品、對照品溶液各20 μl，按“2.2.1”項下方法進樣測定，記錄色譜圖。采用外標(biāo)一點法測定尿酸生成量。

2.3 虎杖不同溶劑提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用的測定

取不同供試品溶液[虎杖總提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物50、100、200 μg/ml 與別嘌呤醇0.5 μg/ml，含1%二甲基亞砜（DMSO）的0.07 mol/L 磷酸緩沖液（PBS）]共200 μl 加入0.07 mol/L PBS140 μl，黃嘌呤氧化酶溶液120 μl（0.02 U/ml，含0.07 mol/L PBS），25 ℃保溫15 min，加入黃嘌呤溶液240 μl（300 μmol/L，含0.07 mol/L PBS），25 ℃保溫15 min，加入1 mol/L鹽酸100 μl終止反應(yīng)。設(shè)空白對照，供試品溶液用含1%DMSO 的0.07 mol/L PBS 代替。采用HPLC法測定尿酸生成量，每組質(zhì)量濃度平行3次，計算抑制率。

2.4 虎杖不同溶劑提取物對黃嘌呤氧化酶抑制動力學(xué)的測定

取不同供試品溶液（虎杖乙酸乙酯提取物40、20、10、5 μg/ml，正丁醇提取物100、80、60、40 μg/ml，含1% DMSO 的0.07 mol/L PBS）200 μl，加入0.07 mol/L PBS140 μl，加入黃嘌呤溶液240 μl（100、75、50、37.5 μmol/L，0.07 mol/L PBS），黃嘌呤氧化酶溶液120 μl（0.05 U/ml，0.07 mol/L PBS），25 ℃保溫1 min，加入1 mol/L 鹽酸100 μl 終止反應(yīng)。設(shè)空白對照，供試品溶液用含1%DMSO的0.07 mol/L PBS代替。采用HPLC法測定尿酸生成量，每組質(zhì)量濃度平行3次，按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖法確定抑制作用類型。

3 結(jié)果

3.1 虎杖不同溶劑提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

陽性對照別嘌呤醇（0.5 μg/ml）抑制率為（59.81±0.70）%，在50、100、200 μg/ml 質(zhì)量濃度下，虎杖正丁醇、乙酸乙酯提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用明顯強于虎杖石油醚、水提取物（均大于50%），且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。虎杖不同溶劑提取物對黃嘌呤氧化酶抑制率的計算結(jié)果見表1。

表1 虎杖不同溶劑提取物對黃嘌呤氧化酶抑制率的計算結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 Results of inhibition rate of different solvent extractions from P.cuspidatum on xanthine oxidase（，n＝3，%）

表1 虎杖不同溶劑提取物對黃嘌呤氧化酶抑制率的計算結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 Results of inhibition rate of different solvent extractions from P.cuspidatum on xanthine oxidase（，n＝3，%）

3.2 虎杖不同溶劑提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制動力學(xué)

在50、100、200 μg/ml 質(zhì)量濃度下，虎杖乙酸乙酯、正丁醇提取物L(fēng)ineweaver-Burk 雙倒數(shù)直線均相交于第二象限，詳見圖1、圖2。通過米氏方程轉(zhuǎn)換式計算米氏常數(shù)（Km，即在酶促反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度一半時所對應(yīng)的底物濃度）和最大酶促反應(yīng)速度（Vmax，即酶被底物飽和時的反應(yīng)速度）。結(jié)果，虎杖乙酸乙酯提取物Km（40 μg/ml）＞Km（20 μg/ml）＞Km（10 μg/ml）＞Km（5 μg/ml）＞Km（0 μg/ml），Vmax（40 μg/ml）＜Vmax（20 μg/ml）＜Vmax（10 μg/ml）＜Vmax（5 μg/ml）＜Vmax（0 μg/ml）；虎杖正丁醇提取物Km（100 μg/ml）＞Km（80 μg/ml）＞Km（60 μg/ml）＞Km（40 μg/ml）＞Km（0 μg/ml），Vmax（100 μg/ml）＜Vmax（80 μg/ml）＜Vmax（60 μg/ml）＜Vmax（40 μg/ml）＜Vmax（0 μg/ml）。Km隨著虎杖乙酸乙酯、正丁醇提取物質(zhì)量濃度的增加而增大，而Vmax則相反，表明虎杖乙酸乙酯、正丁醇提取物抑制機制均為混合型抑制：既能和游離酶結(jié)合，又能和酶-底物復(fù)合物在非活性中心結(jié)合[14]。利用二次作圖法以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中各條直線的斜率和縱軸截距分別對虎杖乙酸乙酯、正丁醇提取物質(zhì)量濃度作圖[15]，計算得虎杖乙酸乙酯提取物對游離酶的抑制常數(shù)（Ki）和對酶-底物復(fù)合物的抑制常數(shù)（Kis）分別為14.46、61.82 μg/ml；虎杖正丁醇提取物Ki和Kis分別為82.97、148.93 μg/ml。兩者對游離酶的抑制作用均強于對酶-底物復(fù)合物的抑制作用?；⒄纫宜嵋阴?、正丁醇提取物對黃嘌呤氧化酶抑制動力學(xué)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖見圖1、圖2（圖中S為濃度，V為速度）。

圖1 虎杖乙酸乙酯提取物對黃嘌呤氧化酶抑制動力學(xué)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig 1 Lineweaver-Burk plots of inhibition kinetics of ethyl acetate extractions from P.cuspidatum on xanthine oxidase

圖2 虎杖正丁醇提取物對黃嘌呤氧化酶抑制動力學(xué)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig 2 Lineweaver-Burk plots of inhibition kinetics of n-butanol extractions from P.cuspidatum on xanthine oxidase

4 討論

篩選抗高尿酸血癥作用的植物資源，系統(tǒng)研究其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，有望研制出高效、低毒、成分清楚、作用機制明確的抗高尿酸血癥多靶點組合物和先導(dǎo)化合物。目前測定黃嘌呤氧化酶活性主要采用NBT/MTS-PMS比色法、紫外分光光度法、辣根過氧化物酶分光光度法、電化學(xué)法和放射化學(xué)法等[16]，應(yīng)用廣泛的紫外分光光度法，由于反應(yīng)體系中天然產(chǎn)物化學(xué)成分、黃嘌呤和尿酸紫外吸收相互干擾，會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。筆者建立了HPLC法測定黃嘌呤氧化酶-黃嘌呤反應(yīng)體系尿酸生成量的體外黃嘌呤氧化酶抑制活性與機制研究方法，優(yōu)化了底物濃度、酶濃度、孵育溫度和孵育時間。本研究應(yīng)用建立的研究方法確定虎杖提取物乙酸乙酯和正丁醇部位為黃嘌呤氧化酶抑制作用的有效部位，兩者均為混合型抑制，為虎杖治療痛風(fēng)的新藥開發(fā)和抑制黃嘌呤氧化酶作用有效成分研究提供了依據(jù)。

[1]Punzi L，So A.Serum uric acid and gout：from the past to molecular biology[J].Curr Med Res Opin，2013，29（Suppl 3）：3.

[2]Puddu P，Puddu GM，Cravero E，et al.The relationship among hyperuricemia，endothelial dysfunction，and cardiovascular diseases：molecular mechanisms and clinical implications[J].J Cardiol，2012，59（3）：235.

[3]Zoccali C，Mallamaci F.Uric acid，hypertension，and cardiovascular and renal complications[J].Curr Hypertens Rep，2013，15（6）：531.

[4]Behradmanesh S，Horestani MK，Baradaran A，et al.Association of serum uric acid with proteinuria in type 2 diabetic patients[J].J Res Med Sci，2013，18（1）：44.

[5]Pacher P，Nivorozhkin A，Szabo C.Therapeutic effects of xanthine oxidase inhibitors：renaissance half a century after the discovery of allopurinol[J].Pharmacol Rev，2006，58（1）：87.

[6]Doghramji PP.Managing your patient with gout：a review of treatment options[J].Postgrad Med J，2011，123（3）：56.

[7]Terkeltaub R，Bushinsky DA，Becker MA.Recent developments in our understanding of the renal basis of hyperuricemia and the development of novel antihyperuricemic therapeutics[J].Arthritis Res Ther，2006，8（Suppl 1）：S4.

[8]EI-Zawawy H，Mandell BF.Managing gout：how is it different in patients with chronic kidney disease?[J].Cleve Clin J Med，2010，77（12）：919.

[9]Burns CM，Wortmann RL.Gout therapeutics：new drugs for an old disease[J].Lancet，2011，377（9 760）：165.

[10]Gaffo AL，Saag KG.Febuxostat：the evidence for its use in the treatment of hyperuricemia and gout[J].Core Evid，2009（4）：25.

[11]孔曉華，周玲芝.中藥虎杖的研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15（5）：108.

[12]侯建平，王亞軍，嚴亞峰，等.虎杖提取物抗動物高尿酸血癥的實驗研究[J].西部中醫(yī)藥，2012，25（5）：21.

[13]Nguyen MTT，Awale S，Tezuka Y，et al.Hypouricemic effects of acacetin and 4，5-O-dicaffeoylquinic acid methyl ester on serum uric acid levels in potassium oxonate-pretreated rats[J].Chem Pharm Bull，2005，28（12）：2 231.

[14]帥麗，楊天鳴，陳婧斯，等.首烏總提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制[J].光譜實驗室，2012，29（2）：745.

[15]袁勤生.現(xiàn)代酶學(xué)[M].上海：華東理工大學(xué)出版社，2001：31.

[16]李忠琴，許小平，楊海麟，等.辣根過氧化物酶分光光度法測定黃嘌呤氧化酶的活性[J].分析化學(xué)，2006，34（6）：821.