楊宗林，李 慧，王 冰，劉淑瑩，2#（.吉林省人參科學(xué)研究院/長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 307；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春 30022）

人參是五加科（Araliaceae）植物人參（Panax ginseng C.A.Meyer.）的干燥根，具有大補元氣的功效[1]，臨床上常用于各種虛證的治療[2]。人參中的主要有效成分是皂苷，其常以人參類植物為主要原料經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（甲醇）煎煮或浸泡后獲得。人參皂苷是一類四環(huán)三萜化合物，在甾體母核上連接糖基側(cè)鏈而得，提取溶劑極性的差異對皂苷的提取率影響較大。

研究[3-5]表明，溶劑不同時，相同提取工藝所得皂苷含量存在差異：諸多研究均以總皂苷為指標(biāo)，且研究結(jié)果各不相同，由于皂苷單體性質(zhì)各不相同，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)提取所得到的皂苷單體含量理論上也應(yīng)存在一定的差異。但卻未見乙醇體積分?jǐn)?shù)對皂苷單體提取率差異的相關(guān)文獻報道。

高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)可以對復(fù)雜體系進行定性定量分析[6-7]，近年來在天然藥物中的應(yīng)用越來越普遍[8]。四極桿-飛行時間MS（Q-TOF MS）技術(shù)具有分辨率高、穩(wěn)定性好、精密度高的優(yōu)點，在化合物定性分析方面應(yīng)用較廣。本文采用Q-TOF液相色譜（LC）/MS技術(shù)鑒定了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇所得提取物中主要的人參皂苷單體，并對其含量進行比較，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)對皂苷提取率的影響。

1 材料

1.1 儀器

1200型液相色譜系統(tǒng)、6520 Accurate Q-TOF儀（美國Agilent公司）；Sigma-Aldrich C18色譜柱（美國Sigma公司）；TU-1810型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

四年生全須生曬參（吉林省紫鑫藥業(yè)有限公司，批號：131120，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Meyer）；人參皂苷Re 對照品（以下簡稱Re，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號：20130770，純度：＞98%）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

將生曬參粉碎成60目粗粉，每份約15 g，料液比設(shè)為1∶10（g/ml），分別采用水和20%、50%、70%、95%（V/V）乙醇溶液回流提取3次，趁熱過濾，合并，減壓濃縮定容至50 ml，得人參提取液。

精確量取提取液1 ml，加蒸餾水9 ml混勻，置于分液漏斗中，加20 ml 乙醚脫脂3 次，棄去乙醚層。向水層中加入20 ml水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，水浴揮干，用適量的甲醇將其溶解，并定容至10 ml，過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 總皂苷的測定

樣品溶液中總皂苷參照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T19506-2009）[9]方法，以Re 為對照品測定，香草醛-冰醋酸顯色，紫外-可見分光光度法測定總皂苷含量。結(jié)果得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝64 709x－94 015（y為峰面積，x為質(zhì)量濃度，r＝0.999 8），線性范圍為1.6～50 μg/ml。經(jīng)方法學(xué)考察，精密度（RSD＝1.07%，n＝5）和準(zhǔn)確度（平均回收率為101.9%，RSD＝0.89%，n＝6）均符合相關(guān)要求。

精密量取“2.1”項下制得的供試品溶液100 μl，至具塞刻度試管中，置于氮氣流中吹干，加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 ml、高氯酸0.8 ml，搖勻，60 ℃水浴加熱10 min，冰水浴冷卻10 min，加入5 ml冰醋酸終止反應(yīng)，于550 nm波長處測定吸光度并計算含量。結(jié)果，以水（0）和20%、50%、70%、95%乙醇溶液提取所得提取液中總皂苷含量分別為1.177、1.220、1.513、1.687、0.451 mg/ml。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于70%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總皂苷含量增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至95%時，總皂苷含量降低。在水提取液中的總皂苷含量與20%乙醇提取液中的總皂苷含量接近，是70%乙醇提取液中總皂苷含量的69%，是95%乙醇提取液中總皂苷含量的2.6倍。

2.3 皂苷單體的檢測條件[10]

樣品中皂苷單體采用Q-TOF LC/MS分析檢測。

色譜條件：色譜柱為Sigma-Aldrich C18（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0→5 min，15%→19%B；5→10 min，19%B；10→28 min，19%→26%B；28→38 min，26%→60%B；38→42 min，60%→100%B）；流速為0.5 ml/min；進樣量為5 μl；柱溫為35 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子模式，掃描范圍m/z200～1 500；霧化器溫度為300 ℃；干燥氣（N2）流速為9 L/min；干燥氣溫度為350 ℃；霧化器壓力為45 psi。

2.4 MS2法確定各物質(zhì)的峰歸屬

選取70%乙醇溶液的人參提取液，以負(fù)離子模式對總皂苷進行檢測，得提取物總離子流色譜圖（TIC），詳見圖1。

由圖1可見，通過HPLC 可以很好地分離溶液中的皂苷化合物，并由MS2獲取化合物分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息，從而確定皂苷單體的種類和名稱。以Re的ESI-MS2為例，說明圖1中所標(biāo)記的16 種人參皂苷單體的碎裂規(guī)律，即提取液中皂苷的鑒定依據(jù)。圖2所示即是在負(fù)離子模式下峰2的ESI-MS圖，圖3是m/z945.54離子的ESI-MS2圖。

圖1 提取物的總離子流色譜圖1.Rg1；2.Re；3.Rf；4.F3；5.Rg2；6.Ra1；7.Rb1；8.Ro；9.Rc；10.Ra2；11.mRc；12.Rb2；13.mRb2；14.Rd；15.20（S）-Rg3；16.20（R）-Rg3Fig 1 TIC of extract1.Rg1；2.Re；3.Rf；4.F3；5.Rg2；6.Ra1；7.Rb1；8.Ro；9.Rc；10.Ra2；11.mRc；12.Rb2；13.mRb2；14.Rd；15.20（S）-Rg3；16.20（R）-Rg3

圖2 Re 的ESI-MS圖Fig 2 ESI-MS spectrum of Re

圖3 m/z 945.54離子的ESI-MS2圖Fig 3 ESI-MS2 spectrum of m/z 945.54 ion

m/z991.55與m/z945.54相差45 Da，由于采用負(fù)離子模式檢測，推測m/z991.55 可能是[M+HCOO]－峰，m/z945.54 離子是準(zhǔn)分子離子[M-H]－，可以初步推測其分子質(zhì)量為946 Da。從圖3 中觀察到了m/z945.54、783.49、637.42 和475.38 的子離子峰，分別對應(yīng)于丟失1～3 個六碳糖基。其中m/z475.38 離子是三醇型皂苷的特征碎片離子，與文獻[11-12]和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)對照，可以確定峰2 所對應(yīng)的化合物為Re。以相同的方法測定其他峰，可以鑒定出圖1中1～16號色譜峰分別為Rg1、Re、Rf、F3、Rg2、Ra1、Rb1、Ro、Rc、Ra2、mRc、Rb2、mRb2、Rd、20（S）-Rg3和20（R）-Rg3。

在鑒定得到的16 種皂苷單體中，Rg1、Rf、Re、F3、Rg2是三醇型皂苷，Ra1、Rb1、Rc、Ra2、Rb2、Rd、Rg3是二醇型皂苷，Ro是齊墩果烷型皂苷，mRc和mRb2是二醇型丙二?；藚⒃碥铡?/p>

可以確定的人參皂苷有16 個，與70%乙醇的人參提取液相比，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取液中各單體皂苷的含量有所變化，即色譜峰面積有所改變，在對TIC進行提取得到的提取離子流色譜進行積分，得到不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取液中各皂苷的峰面積，詳見表1。

表1 人參皂苷結(jié)構(gòu)式及不同提取溶劑中各皂苷的峰面積Tab 1 Construction of ginsenoside and peak area of saponin monomer in different extract solvent

由表2 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于70%時，根據(jù)“相似相溶”原則，大多數(shù)皂苷在提取液中的含量[13]隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到95%時，皂苷含量降低，這與總皂苷的測定結(jié)果一致。

Rg1、Rf、Re、F3、Rg2為三醇型皂苷，在提取溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)由水（0）增加到70%時，其含量逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至95%時含量又有所降低。其中Rg1在70%的乙醇溶液中的含量增加最明顯，而其余3種雖有增加但變化不大。原因可能是5 種皂苷在C3、C6、C20 位均存在羥基，而Re、F3和Rg2均存在葡萄糖和鼠李糖連接的基團，Rg1卻是在C6 和C20位分別連接了2個葡萄糖，可能這種2個葡萄糖分在兩端的連接方式對皂苷的極性影響較大，從而影響其含量的變化。

二醇型皂苷的含量變化跟乙醇體積分?jǐn)?shù)變化關(guān)系并不呈一定的規(guī)律性。其中，Rb1、Rb2在70%乙醇中含量最高，初步分析應(yīng)該是與結(jié)構(gòu)中2個葡萄糖鏈接的基團有關(guān)；而Rg3、Ra2、Rc在水中含量最高，原因可能是C3位均存在glc（2-1）glc的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)對皂苷的極性影響導(dǎo)致其極性較大而在水中的含量最高。Ra1、Ra2、Rb2、Rd在不同的溶劑中其含量變化卻不大，四者均含有2 個葡萄糖鏈接基團的結(jié)構(gòu)，根據(jù)“相似相溶”原理，可能是這4種化合物在其他位置上連接的不同糖基導(dǎo)致其溶解性不同而致使含量變化也不同。

Ro、mRb2、mRc 3種皂苷在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時的含量最高，其中Ro為齊墩果烷型皂苷，而mRb2、mRc均為丙二酰二醇型皂苷，推測其溶解行為一致可能源于丙二酰基的貢獻。

3 討論

謝麗玲等[3]以75%乙醇為最優(yōu)提取工藝得到的皂苷含量最高；劉繼菊[4]在優(yōu)化人參總皂苷的提取條件時考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～100%的提取效果，結(jié)果顯示60%乙醇時效果最好；毛祖林等[5]則以70%乙醇溶液為提取溶劑時人參皂苷提取率高。上述的研究結(jié)果表明，總皂苷含量在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的含量有差異。由于皂苷種類不同生物間活性可能存在較大的差異，僅以提取到的總皂苷量對提取過程進行評價可能具有一定的片面性。此外，各皂苷單體在體內(nèi)的吸收不同，若以皂苷單體進行評價會相對科學(xué)。本研究還就各單體結(jié)構(gòu)分析了其可能存在的原因，這對于不同的試驗需求提供了可靠的乙醇體積分?jǐn)?shù)依據(jù)。

大多數(shù)皂苷單體在70%乙醇中含量最高，原因可能為“相似相溶”原理。70%乙醇與皂苷單體極性最接近。水提取液中所含有的皂苷雖然總量相對70%的乙醇提取液中有所減少，但個別皂苷（如Rg3）的含量卻有所增加，而這部分的皂苷可能具有較高的生物活性，也可能是在提取過程中由于長時間的加熱使得某些皂苷單體不穩(wěn)定而降解使其含量有所升高。

二醇型皂苷跟三醇型皂苷在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇間提取率相差較大，可能是醇羥基的影響，但二醇型皂苷中各單體的提取率變化卻沒有呈現(xiàn)一定的規(guī)律，對于其具體的原因還有待再作考察。

通過Q-TOF LC/MS 技術(shù)，各皂苷單體能夠得到很好的定性定量分析；提取其分子離子峰得到峰面積進行相對定量分析，可為以后的試驗提供便利條件。

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