楊文超，顧正位，路其康，王飛飛，畢云生，張淑瑜，于燕莉#（.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 50355；.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南 5003）

糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是糖尿病導(dǎo)致的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，是造成糖尿病患者死亡的主要原因，目前在我國發(fā)病率逐年攀升[1]。復(fù)方葛根片系濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)院制劑，處方由葛根、丹參、茵陳和延胡索組成，具有活血化瘀、生津養(yǎng)心之功效，臨床主要用于冠心病、心絞痛、心肌梗死等疾病的治療。但通過近幾年院內(nèi)臨床觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)方葛根片還可糾正糖尿病腎病患者的脂質(zhì)代謝紊亂、降低尿蛋白水平，對腎功能具有明顯的改善作用。為深入探討其在此方面的作用，筆者在本研究中采用高糖高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素建立DN大鼠模型[2-4]，觀察復(fù)方葛根片對DN模型大鼠腎組織的影響。

1 材料

1.1 儀器

B600A 型醫(yī)用低速離心機(jī)（河北省安新縣白洋離心機(jī)廠）；穩(wěn)豪型血糖儀[強(qiáng)生（中國）有限公司]；DXC800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）；精密電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（STZ，上海源葉生物科技有限公司，批號：GN0517BA14，純度：≥98.5%，臨用前用檸檬酸緩沖液配制成pH為4.4的1%STZ溶液）；復(fù)方葛根片（濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑室，批號：20141013，規(guī)格：每片0.4 g，其中含生藥量0.3 g）；厄貝沙坦片（陽性藥物，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批號：4A241，規(guī)格：每片150 mg）。

1.3 動物

2 方法

2.1 分組及造模方法

72 只大鼠自購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。大鼠隨機(jī)分為正常組10 只，給予普通飼料喂養(yǎng)；造模組62 只，給予高脂飼料（脂類12.5%、糖20%、膽固醇2.5%、蛋黃粉5%，其余為礦物質(zhì)和維生素）喂養(yǎng)42 d。禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg，正常組給予等體積0.1 mol/L 枸櫞酸緩沖液。造模組72 h后尾部取血測空腹血糖（FBG），以FBG≥16.7 mmol/L、伴有尿量增加者確定造模成功，不達(dá)標(biāo)者予以剔除，并繼續(xù)給予高脂飼料。隨后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組與復(fù)方葛根片高、中、低劑量組，每組10只。

2.2 給藥方法

自DN造模成功1周后開始給藥，給藥量按大鼠與人體型系數(shù)計算[5]，以臨床給藥劑量作中劑量組，2 倍量作高劑量組，0.5倍作低劑量組；陽性對照組給予厄貝沙坦片0.013 g/（kg·d）。復(fù)方葛根片高、中、低劑量組分別給予復(fù)方葛根片0.406、0.203、0.102 g/（kg·d），臨用前加蒸餾水溶解，使給藥量為10 ml/kg；正常組與模型對照組給予等體積蒸餾水。每天灌胃給藥1次，共56 d。其中，部分大鼠在給藥中死亡。給藥56 d末，腹主動脈取血，取腎臟，用于檢測各項指標(biāo)。

2.3 觀察指標(biāo)

（1）一般情況：尿量、飲水量、進(jìn)食量、體質(zhì)量、體毛、精神狀態(tài)等。（2）生化指標(biāo)：在給藥后第1、14、28、42、56 d分別檢測FBG和24 h尿蛋白；末次給藥后，禁食不禁水24 h，腹主動脈取血，取腎臟，檢測血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及腎臟系數(shù)（KI）。（3）腎臟組織病理學(xué)觀察：腎臟用10%中性甲醛固定液固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制備組織切片，脫蠟，蘇木精-伊紅（HE）染色，蓋片后光鏡下觀察[6]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對FBG、24 h 尿蛋白采用重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析進(jìn)行比較[7]，多組間單因素比較先進(jìn)行正態(tài)分析，再采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況變化

造模組大鼠造模6～7 d 后逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量逐漸下降、弓背蜷縮等現(xiàn)象，隨著時間延長，精神萎靡、少動抱團(tuán)的表現(xiàn)越突出。與模型對照組比較，陽性對照組及復(fù)方葛根片高、中、低劑量組大鼠體質(zhì)量、皮毛潤澤度及柔順度、精神和活動量方面均有所改善；正常組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，皮毛潤澤、光潔，動作靈敏，精神飽滿。

3.2 復(fù)方葛根片對DN大鼠FBG的影響

與正常組比較，造模后大鼠FBG明顯升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和復(fù)方葛根片低劑量組大鼠FBG未見明顯變化（P＞0.05），高劑量組大鼠FBG從第42天開始明顯降低（P＜0.05），中劑量組大鼠在第56 天降低明顯（P＜0.05），其中以高劑量組差異最為顯著。各組大鼠FBG測定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠FBG測定結(jié)果（）Tab 1 FBG of rats in each group（）

表1 各組大鼠FBG測定結(jié)果（）Tab 1 FBG of rats in each group（）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 復(fù)方葛根片對DN大鼠24 h 尿蛋白的影響

與正常組比較，造模后各組大鼠24 h 尿蛋白從第28 天開始顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組與復(fù)方葛根片高、中、低劑量組在給藥28 d 后24 h 尿蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。各組大鼠24 h尿蛋白測定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白測定結(jié)果（）Tab 2 24 h Upro of rats in each group（）

表2 各組大鼠24 h尿蛋白測定結(jié)果（）Tab 2 24 h Upro of rats in each group（）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.4 復(fù)方葛根片對DN大鼠SCr、BUN、KI、TC和TG的影響

與正常組比較，模型對照組大鼠BUN、TC、TG、KI水平升高（P＜0.01），同時SCr水平降低（P＜0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組及復(fù)方葛根片高、中劑量組大鼠BUN、TC、TG、KI 水平降低，SCr 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）；復(fù)方葛根片低劑量組SCr 水平升高（P＜0.01），BUN、KI、TC、TG 水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；復(fù)方葛根片各劑量組間比較，SCr、BUN、KI、TC、TG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠SCr、BUN、KI、TC、TG 檢測結(jié)果詳見表3。

表3 各組大鼠SCr、BUN、KI、TC和TG檢測結(jié)果（）Tab 3 SCr，BUN，KI，TC and TG of rats in each group（）

表3 各組大鼠SCr、BUN、KI、TC和TG檢測結(jié)果（）Tab 3 SCr，BUN，KI，TC and TG of rats in each group（）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.5 腎臟組織病理檢查

3.5.1 腎臟的一般形態(tài) 肉眼可見正常組大鼠腎臟色澤紅潤、大小適中，且腎臟表面潤滑有彈性；模型對照組大鼠腎臟呈偏暗黃色，腫脹、增大明顯，有可見斑點；陽性對照組和復(fù)方葛根片各劑量組大鼠腎臟略有腫脹，顏色輕度偏黃。

3.5.2 腎臟的光鏡檢查結(jié)果 正常組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，腎小球系膜細(xì)胞未見增多，系膜區(qū)未見增寬，系膜基質(zhì)未見增加；腎間質(zhì)內(nèi)未見炎細(xì)胞浸潤、充血及水腫；腎間質(zhì)血管壁未見增厚，腎小管結(jié)構(gòu)無異常。模型組大鼠可見腎小球明顯肥大，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生積聚，出現(xiàn)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、部分纖維化及腎小球硬化的病理現(xiàn)象。與模型對照組比較，陽性對照組大鼠腎小球基本正常，腎小管無明顯改變，腎間質(zhì)無纖維化及炎細(xì)胞浸潤；復(fù)方葛根片高、中劑量組大鼠腎臟病變均有所改善，腎間質(zhì)無明顯炎細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)血管壁無明顯增厚，腎小管結(jié)構(gòu)無明顯異常，3 個劑量組間未見明顯差異；低劑量組大鼠腎小球基底膜輕度增厚，系膜基質(zhì)輕度增生，腎間質(zhì)內(nèi)可見部分炎細(xì)胞浸潤，但優(yōu)于模型對照組。各組大鼠腎臟病理組織切片詳見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理組織切片（HE，×100）A.正常組；B.模型對照組；C.陽性對照組；D.復(fù)方葛根片高劑量組；E.復(fù)方葛根片中劑量組；F.復(fù)方葛根片低劑量組Fig 1 Renal pathological tissue section of rats in each group（HE，×100）A.normal group；B.model control group；C.positive control group；D.Compound pueraria tablets high-dose group；E.Compound pueraria tablets medium-dose group；F.Compound pueraria tablets low-dose group

4 討論

DN是在糖尿病基礎(chǔ)上對腎臟造成的慢性進(jìn)行性損傷，在臨床上主要表現(xiàn)為持續(xù)性的蛋白尿。DN 主要的病理特征是腎小球體積肥大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增加，進(jìn)而造成腎小球硬化。從本實驗?zāi)Ｐ蛯φ战M大鼠病理形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果可見腎小球明顯肥大、系膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增生；腎間質(zhì)內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)部分水腫及腎小球硬化。本實驗在第28天時造模各組大鼠蛋白尿量與正常組比較明顯增加（P＜0.01），表明造模組大鼠出現(xiàn)腎功能損害，繼而導(dǎo)致了DN的發(fā)生，可見本次實驗DN模型復(fù)制成功。

本實驗結(jié)果表明，與模型對照組比較，復(fù)方葛根片高、中劑量組FBG、24 h 尿蛋白、BUN、KI、TC、TG 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），SCr 含量明顯升高（P＜0.01），脂質(zhì)代謝紊亂得以糾正，尿蛋白減少，腎組織病理形態(tài)改善。這表明復(fù)方葛根片各劑量對血脂和腎功能有不同程度的改善。實驗中正常組大鼠血清SCr含量高于造模組大鼠，分析原因是造模組大鼠體質(zhì)量減輕，內(nèi)生SCr量隨之減少所致；實驗后期，由于腎小球基底膜通透性增大，濾過增加，導(dǎo)致血清中SCr含量減少。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN 是因糖尿病患病日久，引起瘀血阻滯、深入腎絡(luò)所致，在中醫(yī)學(xué)上屬于“絡(luò)病”的范疇。因此，治療DN應(yīng)以活血化瘀通絡(luò)為主[8-10]。本研究所用復(fù)方葛根片，方中主藥葛根升陽生津、充養(yǎng)血脈，同時兼具活血化瘀之功，藥理研究表明葛根的有效成分葛根素具有清除氧自由基、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善胰島素抵抗、降低血糖血脂的作用[11-12]。丹參性微寒，善能通行血脈、祛瘀通痹，同時又能祛瘀而不傷正、止血而不留瘀；藥理研究表明丹參中丹參酮ⅡA能修復(fù)腎組織、改善微循環(huán)、增加腎組織血流量、改善腎間質(zhì)纖維化并延緩其進(jìn)程[13-14]；丹酚酸B 可以抑制腎小球系膜細(xì)胞的過度增殖，改善基質(zhì)蛋白生成和沉積的狀態(tài)[15]。延胡索辛散溫通，為活血行氣止痛之良藥，與丹參相須配伍，以增強(qiáng)活血祛痹之功。茵陳則可清肝利膽、調(diào)暢氣機(jī)。方中諸藥合用，各秉所長，故能發(fā)揮活血化瘀、生津祛痹之效。

筆者采用生化指標(biāo)聯(lián)合腎臟組織病理學(xué)觀察的方法，探討了復(fù)方葛根片對DN 模型大鼠腎組織的保護(hù)作用。結(jié)果證明，復(fù)方葛根片具有改善大鼠糖尿病腎損傷的作用。

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