孫家躍，左 靖，金義光（.宿州市立醫(yī)院藥劑科，安徽宿州 34000；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥物化學(xué)研究室，北京 00850）

肝臟是人體內(nèi)最大的器官，在消化、儲(chǔ)存能量及生物轉(zhuǎn)化解毒等方面扮演重要的角色。肝癌分為原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌。我國(guó)的肝癌多屬于原發(fā)性肝癌，病死率高，在惡性腫瘤死亡中位居第3 位，僅次于胃癌、食管癌。原發(fā)性肝癌的治療主要包括手術(shù)治療、化療、放療及各種方式綜合治療等[1]，以手術(shù)切除療法為主、同時(shí)運(yùn)用各種手段進(jìn)行綜合治療是目前肝癌治療的主要方案[2-3]。但20世紀(jì)90年代至今，肝癌患者相對(duì)5年生存率一直在10%以下，主要是因?yàn)楦伟┑母邚?fù)發(fā)率和有效治療藥物的缺乏[4]，因此有效、相對(duì)安全的化療藥物的選擇一直是研究熱點(diǎn)。

吉西他濱是核苷類(lèi)抗癌藥，具有高緩解率、可延長(zhǎng)生存期和低副反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，能明顯提高患者的生活質(zhì)量，有效延長(zhǎng)患者的生命，且在門(mén)診使用符合藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)原則。臨床上常應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌等癌癥[5-7]，也有一些報(bào)道吉西他濱聯(lián)合其他抗腫瘤藥物治療肝癌[8-9]。本文將進(jìn)一步研究吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用，為吉西他濱對(duì)肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BS110S 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；Heal Force?力康純水儀（上海康雷分析儀器有限公司）；GL-88B型旋渦混合器（江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠）；TGL-16B 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

吉西他濱原料藥（北京凱萊森醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20110203，純度：99.6%）；DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO，分析純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MTT 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 細(xì)胞株

人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株購(gòu)自北京化工大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；人肝癌HepG2 細(xì)胞株購(gòu)自北京師范大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；小鼠肝癌H22 細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，♂，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

2 方法

2.1 吉西他濱對(duì)HepG2和MCF-7細(xì)胞的抑制作用

將HepG2 和MCF-7 細(xì)胞分別用DMEM 培養(yǎng)液稀釋至1×104個(gè)/ml，接種于兩塊96 孔 板中，200 μl/孔。于5% CO2和37 Ⅵ飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加不同濃度的吉西他濱使其終濃度分別為5、10、20、30、50、70、90 μmol/L。分別作用24、48、72 h后，除去培養(yǎng)液，每孔加20 μl MTT，4 h后加150 μl DMSO 溶解。于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞抑制率，抑制率（%）＝[（不加藥孔OD值－加藥孔OD 值）/加藥孔OD 值]×100%[10]。采用SPSS 軟件Probit回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.2 吉西他濱對(duì)小鼠肝腫瘤的抑制作用

將H22細(xì)胞株復(fù)蘇稀釋后于無(wú)菌條件下接種在小鼠腹腔內(nèi)增殖7 d，從瘤株生長(zhǎng)較好的小鼠腹腔抽取H22細(xì)胞液，生理鹽水稀釋至2×1010個(gè)/L，取0.2 ml 皮下接種于小鼠右前腋下，10 d 后，手觸有硬塊即為瘤接種成功。挑取10 只荷瘤大小均勻的小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水）與吉西他濱組（40 mg/kg），每組5 只，每隔2 d 尾iv 藥物1 次，共給藥3 次[11]。觀察小鼠毛發(fā)和精神狀態(tài)，記錄每天體質(zhì)量變化。末次給藥后第2天處死小鼠，摘取實(shí)體瘤，稱(chēng)瘤濕質(zhì)量，計(jì)算吉西他濱的抑瘤率。抑瘤率（%）＝（對(duì)照組平均瘤濕質(zhì)量－吉西他濱組平均瘤濕質(zhì)量）/對(duì)照組平均瘤濕質(zhì)量×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α＝0.05，比較各組間差異。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 吉西他濱對(duì)MCF-7和HepG2細(xì)胞的抑制作用

作用24 h 時(shí)，吉西他濱對(duì)MCF-7 的IC50為30 μmol/L，對(duì)HepG2 的IC50＞90 μmol/L；而作用48、72 h 時(shí)，吉西他濱對(duì)MCF-7 和HepG2 的IC50均＜5 μmol/L。吉西他濱作用24 h 時(shí)對(duì)MCF-7 細(xì)胞的抑制率均大于對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。吉西他濱對(duì)MCF-7 細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)圖1。

圖1 吉西他濱對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制作用A.24 h；B.48 h；C.72 hFig 1 Inhibitory effect of gemcitabine on MCF-7 cells and HepG2 cellsA.24 h；B.48 h；C.72 h

3.2 吉西他濱對(duì)荷瘤小鼠精神狀態(tài)和體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組荷瘤小鼠逐日消瘦，運(yùn)動(dòng)量減少，精神不振，毛發(fā)暗沉；而吉西他濱組荷瘤小鼠食欲正常，毛發(fā)有光澤，較活躍。對(duì)照組荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的增加消除了消瘦帶來(lái)的體質(zhì)量減少，導(dǎo)致其與吉西他濱組荷瘤小鼠的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此小鼠體質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。兩組荷瘤小鼠的體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3 吉西他濱對(duì)荷瘤小鼠的抗腫瘤作用

對(duì)照組荷瘤小鼠的實(shí)體瘤濕質(zhì)量分別為4.4、3.3、4.3、4.5、5.3 g，平均質(zhì)量為（4.36±0.64）g；吉西他濱組荷瘤小鼠的實(shí)體瘤濕質(zhì)量分別為1.9、0.9、0.9、1.1、0.8 g，平均質(zhì)量為（1.12±0.41）g，吉西他濱對(duì)荷瘤小鼠的抑制率為75.76%。

圖2 兩組荷瘤小鼠的體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果Fig 2 Body weight of tumor-bearing mice in 2 groups

4 討論

吉西他濱是一線抗腫瘤藥物，對(duì)癌細(xì)胞有較強(qiáng)的殺滅作用。但目前其臨床應(yīng)用大多局限于對(duì)其特殊敏感的癌細(xì)胞，如乳腺癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等，在肝癌的治療上卻應(yīng)用較少。本研究結(jié)果顯示，≥30 μmol/L的吉西他濱體外作用72 h，對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用與其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用相當(dāng)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也初步表明，吉西他濱對(duì)小鼠H22實(shí)體瘤有較好的抑制作用。筆者認(rèn)為臨床上未將吉西他濱作為肝癌治療首選藥的主要原因可能是吉西他濱的肝組織分布不夠高，在肝周?chē)灰走_(dá)到較高的治療濃度，且較低的肝靶向性易引起較嚴(yán)重的副作用。筆者建議將吉西他濱與靶向材料相結(jié)合制成靶向肝組織的抗肝癌藥物，應(yīng)會(huì)有較廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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