曾 媛,鄭露露,熊 磊,劉 輝#,段 婷(.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;.湖北中醫(yī)藥大學藥學院,武漢 430065)
鹽酸苯環(huán)壬酯(PCH)是我國軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所發(fā)明的新一代高選擇性中樞抗膽堿能抗暈動病Ⅰ類新藥[1-2],擁有中國專利2項和英美專利各1項。其制劑鹽酸苯環(huán)壬酯片用于暈動病的防治,具有療效可靠、中樞不良反應(yīng)小的優(yōu)點[3-5]。由于其給藥劑量?。? mg/d),此劑量下,鹽酸苯環(huán)壬酯的血藥濃度極低[6],因此需要建立簡單快速、選擇性強且靈敏度高的方法用于血藥濃度檢測。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法建立了鹽酸苯環(huán)壬酯片在Bealge犬體內(nèi)的血藥濃度測定方法,為鹽酸苯環(huán)壬酯緩釋制劑的開發(fā)與臨床前研究提供了可靠保證。
1260 型HPLC 系統(tǒng),包括二元高壓泵系統(tǒng)、自動進樣器和切換閥(美國Agilent 公司);API3200 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,包括電噴霧離子化源(美國AB Sciex公司);Anke TGL-16B型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。
鹽酸苯環(huán)壬酯對照品(批號:100716-200501,純度:100%)、鹽酸戊乙奎醚對照品(批號:100931-201101,純度:100%)購自中國食品藥品檢定研究院;鹽酸苯環(huán)壬酯片(北京華素制藥股份有限公司,批號:13082916,規(guī)格:每片2 mg);乙腈、甲酸為色譜純,水為雙重蒸餾水,其余試劑均為分析純。
色譜柱:Agilent C18(50 mm×3.0 mm,2.7 μm);流動相:乙腈-0.01%甲酸水溶液(60∶40,V/V),流速:0.4 ml/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10μl。
離子源為電噴霧離子源(ESI 源),正離子方式檢測,采用選擇性多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)同時測定苯環(huán)壬酯和內(nèi)標戊乙奎醚,掃描時間0.2 s。氣簾氣(CUR):25 psi;霧化器(GS1):40.0 psi;輔助加熱器(GS2):55 psi;碰撞氣(CAD):5.0 psi;離子噴霧電壓(IS):5 500.00 V,離子源溫度(TEM):600 。離子去簇電壓(DP):61 V(苯環(huán)壬酯)、70 V(戊乙奎醚);入口電壓(EP):11 V(苯環(huán)壬酯)、10 V(戊乙奎醚);碰撞能量(CE):45 eV(苯環(huán)壬酯)、55 eV(戊乙奎醚);用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z358.3→m/z156.1(苯環(huán)壬酯)、m/z316.1→m/z128.1(戊乙奎醚)。
2.3.1 鹽酸苯環(huán)壬酯標準溶液 精密稱取鹽酸苯環(huán)壬酯對照品10 mg,置于100 ml 量瓶中,加乙腈適量,振搖使溶解,加乙腈稀釋至刻度,搖勻,即得100μg/ml 的鹽酸苯環(huán)壬酯貯備液。取該貯備液1 ml,置于100 ml 量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,得1μg/ml的鹽酸苯環(huán)壬酯對照品溶液。取上述對照品溶液,以乙腈依次倍比稀釋,制備成質(zhì)量濃度分別為150、100、50、10、5、1 ng/ml 的鹽酸苯環(huán)壬酯標準溶液,置于4 ℃冰箱保存,備用。
2.3.2 內(nèi)標溶液 精密稱取鹽酸戊乙奎醚對照品10 mg,置于100 ml量瓶中,加乙腈適量,振搖使溶解,加乙腈稀釋至刻度,搖勻,即得100μg/ml鹽酸戊乙奎醚貯備液。取該貯備液適量,加乙腈倍比稀釋至250 ng/ml,作為內(nèi)標溶液,置于4 ℃冰箱保存,備用。
取血漿樣品200 μl,加入20μl內(nèi)標溶液(250 ng/ml),渦漩混勻;再加入400 μl 乙腈,渦旋30 s 后,以離心半徑3 cm(下同)、10 000 r/min 離心5 min,取上清液10μl,進行HPLC-MS/MS定量分析。
分別取鹽酸苯環(huán)壬酯貯備液和鹽酸戊乙奎醚貯備液,首先經(jīng)Q1掃描選擇母離子,然后進行二級質(zhì)譜掃描。根據(jù)質(zhì)譜圖分析結(jié)果,進行MRM 掃描:苯環(huán)壬酯為358.3/156.1(m/z),內(nèi)標戊乙奎醚為316.1/128.1(m/z)。取空白血漿、空白血漿+鹽酸苯環(huán)壬酯對照品溶液+內(nèi)標溶液、犬給藥后15 min的血漿樣品+內(nèi)標溶液,按“2.4”項下方法處理后,進行HPLC-MS/MS法分析。結(jié)果,空白血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)和代謝物不干擾鹽酸苯環(huán)壬酯及內(nèi)標的測定,鹽酸苯環(huán)壬酯和內(nèi)標的保留時間分別為0.692、0.634 min。MRM色譜圖見圖1。
圖1 MRM色譜圖A.空白血漿;B.空白血漿+鹽酸苯環(huán)壬酯+內(nèi)標;C.血漿樣品+內(nèi)標;1.內(nèi)標;2.鹽酸苯環(huán)壬酯Fig 1 MRM chromatogramsA.blank plasma;B.blank plasma+PCH+internal standard;C.plasma sample+internal standard;1.internal standard;2.PCH
取空白血漿180 μl,共12份,加入“2.3.1”項下的鹽酸苯環(huán)壬酯標準溶液20 μl,制備成鹽酸苯環(huán)壬酯的質(zhì)量濃度為15.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 ng/ml 的質(zhì)控樣品,按“2.4”項下方法處理,每一濃度進行雙樣本分析,進樣10μl,記錄色譜。以鹽酸苯環(huán)壬酯和內(nèi)標峰面積比值(y)為縱坐標、鹽酸苯環(huán)壬酯質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重系數(shù):1/c2)進行線性回歸,得回歸方程為y=0.995 3x+0.066 1(r=0.999 6)。結(jié)果,鹽酸苯環(huán)壬酯檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.1~15.0 ng/ml,定量限為0.1 ng/ml(信噪比為10)。
取空白血漿180 μl,按“2.6”項下方法制備鹽酸苯環(huán)壬酯質(zhì)量濃度分別為12、7、0.3 ng/ml 的質(zhì)控樣品,各5 份,按“2.4”項下方法處理,進樣獲得相應(yīng)色譜峰面積。以其與已知濃度比較計算方法回收率,以其與標準溶液比較計算提取回收率;同一批時間內(nèi)完成血漿樣品處理測定5次考察批內(nèi)精密度,連續(xù)測定3批考察批間精密度。回收率與精密度試驗結(jié)果見表1。
表1 回收率與精密度試驗Tab 1 Results of extraction and precision tests
取-80 ℃保存0、7、14、21、28 d的血漿樣品,按“2.4”項下方法處理后,測定其濃度;同法測定反復冷凍-解凍循環(huán)3次的血漿樣品和處理后再室溫放置0、2、4、8、12、24 h 的血漿樣品。結(jié)果,鹽酸苯環(huán)壬酯血漿樣品在-80 ℃條件下能穩(wěn)定保存28 d(RSD=7.2%,n=5);反復凍融3 次并不影響血藥濃度測定(RSD=8.9%,n=3);處理后的血漿樣品在室溫條件下能穩(wěn)定保存24 h(RSD=5.6%,n=6)。
取空白血漿180μl,共6 份,加入400 μl 乙腈沉淀蛋白后,分別加入鹽酸苯環(huán)壬酯標準溶液和內(nèi)標溶液,制備成鹽酸苯環(huán)壬酯質(zhì)量濃度為12、7、0.3 ng/ml,內(nèi)標質(zhì)量濃度為23 ng/ml的對照血漿,按“2.4”項下方法處理后,進行HPLC-MS/MS 法分析獲得峰面積。以其與相應(yīng)質(zhì)量濃度的鹽酸苯環(huán)壬酯標準溶液和內(nèi)標溶液的混合溶液直接進樣獲得的峰面積之比評價基質(zhì)效應(yīng),比值均在90%~110%之間,表明本試驗建立的鹽酸苯環(huán)壬酯測定方法不受基質(zhì)效應(yīng)的影響。
取犬6 只,實驗前1 d 晚8 點開始禁食,實驗當天早上8 點分別ig 鹽酸苯環(huán)壬酯片2 mg 和4 mg。給藥后2 h 內(nèi)禁水,給藥4 h 后正常進食進水。給藥和實驗期間盡量避免犬劇烈運動,食物為低脂肪標準餐。于給藥前5 min 和給藥后0.17、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、24、36 h時用肝素化真空采血管取前肢靜脈血2 ml,4 000 r/min離心10 min,按“2.4”項下方法處理后,采用HPLC-MS/MS 法測定鹽酸苯環(huán)壬酯的血藥濃度。2 周后交叉給藥同法測定血藥濃度。利用DAS2.0 軟件按一級吸收二室模型計算藥動學參數(shù)。犬血漿中鹽酸苯環(huán)壬酯的藥-時曲線見圖2;藥動學參數(shù)見表2(表中“*”表示高于定量上限濃度的樣品采用相應(yīng)的空白血漿稀釋后重新測定的濃度)。
圖2 犬血漿中鹽酸苯環(huán)壬酯的藥-時曲線(n=6)Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of PCH in the plasma of dogs(n=6)
表2 鹽酸苯環(huán)壬酯片在犬體內(nèi)的藥動學參數(shù)(,n=6)Tab 2 The pharmacokinetic parameters of PCH tablets in dogs(,n=6)
表2 鹽酸苯環(huán)壬酯片在犬體內(nèi)的藥動學參數(shù)(,n=6)Tab 2 The pharmacokinetic parameters of PCH tablets in dogs(,n=6)
犬ig 鹽酸苯環(huán)壬酯片劑2 mg 和4 mg 后,藥動學參數(shù)tmax、t1/2α、t1/2β、MRT0-36h經(jīng)t檢驗,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明藥物的吸收、分布、消除不受劑量影響;AUC0-36h、cmax經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并與服藥劑量的倍增一致。此結(jié)果與人口服鹽酸苯環(huán)壬酯片劑2 mg和4 mg的研究[7]相符。
本實驗中測定的鹽酸苯環(huán)壬酯為外消旋體,因R-鹽酸苯環(huán)壬酯、S-鹽酸苯環(huán)壬酯在有機相比例較低的情況下易于色譜分離,因此采用較高的有機相比例。此時分析物和內(nèi)標能達到色譜分離目的,但分析物峰形拖尾明顯,保留時間較長(>5 min)。在水相中添加一定比例的甲酸,有利于正離子質(zhì)子化,維持樣品在流動相中的電離狀態(tài),此時分析物和內(nèi)標的峰形得到改善,具有很好的對稱性,且分析時間縮短至0.7 min。最終優(yōu)化確定流動相為乙腈-0.01%甲酸水溶液(60∶40)。
本文建立的HPLC-MS/MS 法對于內(nèi)標與鹽酸苯環(huán)壬酯、與雜質(zhì)的色譜分離要求更高。實驗中曾篩選了硫酸阿托品、硝酸毛果蕓香堿、鹽酸戊乙奎醚等多個內(nèi)標候選物[8-9],綜合保留時間、雜質(zhì)干擾因素,最終選擇鹽酸戊乙奎醚為內(nèi)標。
在臨床前研究鹽酸苯環(huán)壬酯代謝時,曾采用過放射性同位素分析方法和放射受體分析方法,其給藥劑量分別為1 mg/kg和0.5 mg/kg,檢測靈敏度僅為5 ng/ml[10]。筆者建立了一種靈敏度高、選擇性強的HPLC-MS/MS 法用于Beagle 犬血漿樣品中鹽酸苯環(huán)壬酯的定量分析,方法靈敏度達到了0.1 ng/ml,滿足鹽酸苯環(huán)壬酯在Beagle犬體內(nèi)藥動學研究的要求。
本方法采用鹽酸戊乙奎醚為內(nèi)標,較之同位素標記的內(nèi)標物更容易獲得也更價廉,具有可推廣性;采用乙腈直接沉淀蛋白,簡化了實驗步驟,縮短了測定時間,有利于實現(xiàn)大批量樣本的快速分析。筆者應(yīng)用此方法進行了不同給藥劑量的鹽酸苯環(huán)壬酯片口服給藥后Beagle犬體內(nèi)藥動學研究。在各分析批次樣品中均勻隨機放置高、中、低3 個濃度的質(zhì)控樣品,以此監(jiān)控分析過程的有效性和準確性。結(jié)果顯示,質(zhì)控合格率為98%。
對于本研究結(jié)果中出現(xiàn)某些藥動學參數(shù)s大于x的現(xiàn)象,考慮是由于試驗樣本量(n=6)少、實驗對象存在個體差異造成的。在后期研究過程中,將通過增加樣本量來避免此類問題的出現(xiàn)。
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