徐麗娟，王淑芳，張云巍，潘美妍，胡亞卓，閻　麗　(.解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科，北京 0085；.解放軍總醫(yī)院輸血科，北京 0085；.解放軍濟南軍區(qū)第二療養(yǎng)院，山東 濟南 50000；.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學研究所病理科，北京 0085)

·論著·

CXCR4基因慢病毒表達載體的構(gòu)建、包裝及鑒定

徐麗娟1，王淑芳2，張云巍1，潘美妍3，胡亞卓4，閻麗1(1.解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科，北京 100853；2.解放軍總醫(yī)院輸血科，北京 100853；3.解放軍濟南軍區(qū)第二療養(yǎng)院，山東 濟南 250000；4.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學研究所病理科，北京 100853)

[摘要]目的構(gòu)建CXCR4基因慢病毒過表達載體并對其進行包裝、鑒定。方法首先設(shè)計合成引物，采用PCR法擴增目的基因CXCR4，將目的基因與酶切線性化的載體進行定向交換，成功構(gòu)建重組載體慢病毒表達載體pGC-FU-CXCR4，將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。對培養(yǎng)出的克隆先進行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，最后將獲得的病毒載體共同轉(zhuǎn)染293T細胞，收集病毒顆粒，并采用Real time PCR法測定病毒滴度。結(jié)果PCR鑒定結(jié)果顯示擴增的目的基因已成功插入pGC-FU載體，Western Blot結(jié)果顯示得到的片段與理論大小相符，陽性克隆測序結(jié)果與目的基因序列一致，說明重組慢病毒載體的插入序列完全正確。結(jié)論本實驗成功構(gòu)建了CXCR4慢病毒表達載體，并成功對慢病毒進行了包裝及病毒滴度測定。

[關(guān)鍵詞]慢病毒載體；CXCR4基因；293T 細胞

CXC型趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)是基質(zhì)細胞衍生因子(stromal derived factor1，SDF-1，又稱為CXCL12)的受體，CXCR4是G蛋白偶聯(lián)受體，含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域[1]。SDF-1為CXCR4唯一特異性配體，兩者共同構(gòu)成SDF-1/CXCR4軸，不僅在人類免疫缺陷病毒感染、炎性反應和創(chuàng)傷修復等病理生理過程中發(fā)揮重要作用，而且在正常細胞和腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡等細胞生物學行為及分子水平的調(diào)控中起重要作用[2-3]。干細胞移植是目

前治療終末期肝病及急、慢性重癥肝炎的一種新的治療手段，目前較為常用的成體間充質(zhì)干細胞(adult mesenchymal stem cells，ADSCs)有包括骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)、外周血干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞等，其中最為常用的為骨髓間充質(zhì)干細胞。但研究顯示僅有少數(shù)BMSCs能夠定植于受損的肝臟組織，這限制了干細胞移植治療肝損傷的有效性[4-5]。CXCR4高表達于骨髓間充質(zhì)干細胞，但體外擴增培養(yǎng)的BMSCs隨培養(yǎng)代數(shù)的增加，CXCR4的表達水平卻逐漸降低，并逐漸失去了其向受傷組織遷移分化的能力[6-7]。慢病毒表達載體由慢病毒衍生而來，慢病毒是一組復雜的反轉(zhuǎn)錄病毒，可引起人和哺乳動物緩慢的慢性免疫缺陷疾病。慢病毒對分裂和非分裂細胞都能有效感染，慢病毒表達載體的設(shè)計也是利用了慢病毒能夠整合到感染細胞的基因組中并能夠較長期穩(wěn)定地表達導入的目的基因或片段獨特特性。為進一步研究提高移植的BMSCs的CXCR4表達水平是否能夠促進修復受損肝臟組織，本研究構(gòu)建了pGC-FU-CXCR4-柔性肽-GFP慢病毒表達載體。

1材料與方法

1.1主要試劑和材料

pGC-FU Vector 載體(GENECHEM公司)；1 kp DNA ladder Marker(Fermentas公司)；250 bp DNA ladder Marker(捷瑞公司)； Age I(NEB公司)；In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech)；Taq polymerase(SinoBio)；dNTP(Takara)；Primer(捷瑞生物)；Plasmid 抽提 Kit(Promega)；大腸桿菌。

1.2實驗方法

1.2.1pGC-FU Vector 載體的構(gòu)建pGC-FU Vector 慢病毒載體信息，見圖1。

圖1　慢病毒載體信息

1.2.2慢病毒載體的酶切Age I進行酶切消化：取ddH2O 42 μl，10×buffer 15 μl，純化的DNA質(zhì)粒(1 μg/μl)2 μl，Age I(5 U/μl)1 μl，總體積50 μl，構(gòu)成酶切反應體系，將上述混合物置于37 ℃，反應2 h。

1.2.3目的基因片段的獲取引物合成，引物信息如下：①CXCR4-Age I-F序列為GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGAAATATACACTTCGGA，該引物含交換配對堿基、Age I 酶切位點(下劃線標記)以及表達增強序列(雙下劃線記)，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR釣取目的基因。②CXCR4-Age I-R序列為TCACCATGGTGGCGACCGGGCTTCCTCCGCCTCCGCTTCCGCCTCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCTGGAG

TGAAAACTTGAG，該引物含交換配對堿基和Age I 酶切位點(下劃線標記，為了調(diào)整讀碼框去掉了T堿基)，并含有目的基因3’端部分序列用于PCR釣取目的基因，雙下劃線標記的為柔性肽序列。③CXCR4-SEQF序列為CTGACTATCCCTGACATCATC，該引物位于目的基因中，用于菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。④Ubi-F序列為GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG，該引物位于Ubiquitin啟動子中，用于菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子以及測序。⑤EGFP-N-R序列為CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，該引物位于EGFP基因的N端，用于菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子以及測序。

1.2.4PCR擴增目的基因擴增程序如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸90 s，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。抽取擴增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，用DNA marker 來判斷擴增片段的大小。

1.2.5重組克隆制備及細胞轉(zhuǎn)染用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞備用，PCR產(chǎn)物交換進入線性化慢病毒載體，建立反應體系(表1)，25 ℃反應30 min，42 ℃反應15 min后準備轉(zhuǎn)化。將反應體系轉(zhuǎn)染已制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h。長出的克隆進行后續(xù)PCR鑒定。

表1　反應體系的建立

1.2.6陽性克隆的PCR鑒定用PCR擴增的方法鑒定陽性克隆。建立PCR反應體系，反應條件如下：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸40 s，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃冷卻。電泳鑒定PCR產(chǎn)物。接種陽性轉(zhuǎn)化子，37 ℃培養(yǎng)16 h后保存為甘油菌，分裝并測序。

1.2.7慢病毒顆粒的包裝和滴度測定取生長良好的293T細胞，用pGC-LV 載體，pHelper 1.0載體，pHelper 2.0載體共同轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染8 h后，棄掉含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，注意動作應輕柔，避免洗掉貼壁的細胞，用含10%FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，保存?zhèn)溆?。在病毒滴度測定的前1 d傳代293T細胞，并調(diào)整細胞密度，次日，分別將不同濃度的病毒稀釋液(1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4μl)加入到293T細胞中，培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基，4 d后抽提RNA并采用Real time PCR法測定病毒滴度。

2結(jié)果

以含有CXCR4基因的質(zhì)粒為模板，采用特異引物，擴增CXCR4基因片段，產(chǎn)物長度為1 138 bp，電泳可見特異條帶，與預期結(jié)果一致，結(jié)果見圖2；將陽性克隆進行PCR鑒定，2個陰性對照組沒有明顯的蛋白印跡，陽性對照組和實驗組均有較明顯的印跡，而感染慢病毒顆粒印跡較強，說明構(gòu)建表達CXCR4基因的慢病毒載體可高效表達CXCR4蛋白。陽性克隆得到682 bp條帶，與預期一致，見圖3；目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h，293T細胞熒光表達結(jié)果呈陽性，結(jié)果見圖4；Western blot法驗證PGC-FU-CXCR4質(zhì)粒為CXCR4的過表達慢病毒載體，目的基因融合GFP共同表達，見圖5；采用Real time定量PCR法測定包裝的病毒滴度，病毒包裝滴度為：2×108TU/mL，見圖6、表2。

在本次滴度檢測中，1×10-4μl組樣品和對照組組樣品的Ct值存在3個左右差異，認為在1×10-4μl組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少有1個病毒顆粒，則病毒的滴度為：1/(1×10-4) ×20=2×105TU/μl=2×108TU/mL。

marker：5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

1：陰性對照(ddH2O)；2：陰性對照(空載自連對照組)；3：陽性對照(GAPDH)；4： Marker 5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；5～12：CXCR4-1～8號轉(zhuǎn)化子

圖3PCR陽性克隆鑒定圖片

圖4　轉(zhuǎn)染后24 h 293T細胞熒光表達結(jié)果(×200)

圖5　CXCR4-GFP融合蛋白的表達

圖6　Real-time PCR 曲線圖

組別CtActinCtTargetgene均值△Ct=CtTargetgene均值-CtActin△Ct對照組-△Ct樣品組對照組14.2336.1721.9400.000樣品組1×100μl14.3520.3155.96515.9751×10-1μl14.2923.519.22012.7201×10-2μl14.4827.16512.6859.2551×10-3μl14.3530.46516.1155.8251×10-4μl14.6733.23518.5653.375

3討論

通過此次研究，我們成功構(gòu)建了CXCR4慢病毒表達載體，并采用瓊脂糖凝膠電泳法、Western blot法、Real time定量PCR法、病毒滴度測定進行了證實。CXCR4廣泛表達在各種不同的外周組織中，包括淋巴組織、胸腺、腦、脾，并且已在乳腺、結(jié)腸、胃、卵巢、肺、前列腺、黑素瘤和胰腺的腫瘤細胞的細胞表面上檢測到CXCR4的表達[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12/CXCR4不僅參與機體免疫和造血干細胞遷移等生理過程調(diào)節(jié)，并被認為是多種不同細胞信號轉(zhuǎn)導中的關(guān)鍵分子[11]。CXCL12/CXCR4能啟動多個信號傳導途徑并能促進細胞趨化、增殖，提高細胞內(nèi)鈣離子濃度和基因轉(zhuǎn)錄[8,10]。這些正常的生理反應還與多個病理過程共享多個下游信號轉(zhuǎn)導通路，包括腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，以及自身免疫性和炎癥性疾病[8]。此外，CXCL12/CXCR4也可以激活腫瘤細胞中的許多信號傳導途徑，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶[12-13]。因此，CXCL12/CXCR4信號傳導途徑可作為多種疾病潛在的治療靶點。

最近已有學者提出，CXCL12/CXCR4信號途徑在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的多個方面包括血管生成、轉(zhuǎn)移和生存等起著重要作用[14]。CXCR4的高表達原發(fā)性腫瘤比CXCR4低表達的原發(fā)性腫瘤表現(xiàn)較高的增殖和轉(zhuǎn)移能力[15]。Sehgal等[16]的研究結(jié)果顯示膠質(zhì)母細胞瘤表達高CXCR4，而經(jīng)過CXCR4特異性抗體治療后，膠質(zhì)母細胞瘤的細胞增殖顯著降低。在大腸癌組織中，比相應的正常組織，CXCL12顯著下調(diào)和CXCR4是顯著上調(diào)[17]。CXCR4的高表達可能加快腫瘤進展，并被認為是胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌患者生存預后不良的因素[18-19]。然而，最近已經(jīng)報道，降低CD34+細胞CXCR4的表達可能會引發(fā)原發(fā)性骨髓纖維化[18]。Bogani等[20]從原發(fā)性骨髓纖維化患者的CD34+細胞發(fā)現(xiàn)CXCR4啟動子的超甲基化，并在用5-dAzaC治療的原發(fā)性骨髓纖維化患者細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白的表達增加了3～10倍。鑒于CXCR4受體介導的上述多種重要生物學功能，及在腫瘤發(fā)展過程中的重要作用，CXCR4/SDF-1受體的抑制劑，在將來有望成為艾滋病、癌癥、炎癥和關(guān)節(jié)炎等疾病的治療方法。

常用的病毒性載體包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、痘苗病毒載體和單純皰疹病毒載體等。慢病毒載體是以人類免疫缺陷1型病毒(HIV-1) 為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。相較于其他病毒性載體，慢病毒表達載體具有獨特的優(yōu)越性，其轉(zhuǎn)染效率高，可以有效轉(zhuǎn)導分裂和非分裂細胞，慢病毒載體整合進入宿主細胞基因組中，能穩(wěn)定的表達轉(zhuǎn)基因和維持轉(zhuǎn)基因的種系傳遞，并且轉(zhuǎn)導的細胞能保留自我復制和亞全能性的性能，因此被廣泛應用于基因功能研究和基因治療領(lǐng)域[21-22]。

鑒于CXCR4基因在眾多生理病理過程中的重要作用，以及科研和臨床都急需建立高效穩(wěn)定安全的CXCR4慢病毒載體。因此，我們探索了一種穩(wěn)定的CXCR4慢病毒基因表達載體的構(gòu)建方法，并成功對其進行了包裝，而且鑒定結(jié)果也表明pGC-FU-CXCR4慢病毒載體成功構(gòu)建，為下一步針對CXCR4基因的體內(nèi)實驗提供了可行性。

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(編輯：楊穎)

Construction,package and identification of lentiviral vector for CXCR4 gene

XU Li-juan1,WANG Shu-fang2,ZHANG Yun-wei1,PAN Mei-yan3,HU Ya-zhuo4,YAN Li1(1.Department of Gastroenterology,Institute of Geriatrics,General Hospital of PLA，Beijing 100853,China；2.Blood Transfusion Department，General Hospital of PLA，Beijing 100853,China；3.Second Sanatorium，Jinan Military Region,Jinan Shandong 250000,China;4.Department of Pathology,Institute of Geriatrics，General Hospital of PLA，Beijing 100853,China)

Abstract:ObjectiveTo construct and identify lentiviral vector pGC-FU-CXCR4 gene. MethodsCXCR4 gene amplification was used by real-time polymerase chain reaction.The target gene fragments with the digested plasmids were exchange.Then the lentiviral vector pGC-FU-CXCR4 was constructed successfully.Use the constructed lentiviral vector to infect the competent escherichia coli cells.Polymerase chain reaction analysis was used to identify the cultural clones and DNA sequencing and comparative analysis were used to positive fragments.The successfully constructed plasmids had the same sequence with the target gene. ResultsPolymerase chain reaction tests showed that amplified target genes were inserted in pGC-FU vectors.The electrophoresis results,digestion showed that the reconstructed plasmid was consistent with the theoretical fragment and the sequence result of the positive fragments were exactly the same with the target gene. ConclusionLentiviral vectors of CXCR4 gene over-expression were successfully constructed.

Keywords:lentiviral vector;CXCR4 Gene;293T cell

[收稿日期]2015-01-27[修回日期] 2015-02-15

[通訊作者]閻麗,E-mail：yanlifmu@126.com

[基金項目]國家自然科學基金(30900669)；北京市科技新星計劃基金(ZXKTYANLI001)

doi:10.11659/jjssx.01E015050

[中圖分類號]Q344+.13

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)05-0473-04