康　健，袁　文，常正奇，孫海寧，于秀淳　(.濟南軍區(qū)總醫(yī)院骨病科，山東 濟南 5003;.上海長征醫(yī)院骨科，上海 00003)

富血小板凝膠促軟骨細胞增殖的體外實驗研究

康健1，袁文2，常正奇1，孫海寧1，于秀淳1(1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院骨病科，山東 濟南 250031;2.上海長征醫(yī)院骨科，上海 200003)

[摘要]目的利用二次離心法制備富血小板凝膠，將其與軟骨細胞復合，觀察軟骨細胞增殖與表達，為組織工程軟骨構建提供良好支架材料。 方法將兔靜脈血使用二次離心法制備富血小板血漿，檢測其中多種生長因子濃度，并與分離培養(yǎng)的兔軟骨細胞混合后以激活劑激活，培養(yǎng)并以MTT法觀察軟骨細胞增殖情況，使用realtime-PCR方法檢測軟骨細胞蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和SOX-9基因表達，并與普通培養(yǎng)軟骨細胞比較，明確富血小板凝膠與軟骨細胞混合后軟骨細胞增殖表達情況。 結果富血小板凝膠萃取液中PDGF-AB、TGF-β1、IGF-1、VEGF生長因子濃度明顯高于全血(P<0.05)。富血小板凝膠與軟骨細胞復合培養(yǎng)，軟骨細胞增殖速度明顯高于普通培養(yǎng)軟骨細胞(P<0.05)。培養(yǎng)7 d后檢測軟骨細胞中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和SOX-9基因表達明顯高于普通軟骨細胞(P<0.05)。結論富血小板凝膠與軟骨細胞共培養(yǎng)，可明顯促進軟骨細胞增殖和表達，是優(yōu)良的組織工程軟骨構建方案。

[關鍵詞]富血小板凝膠；軟骨細胞；組織工程；生長因子

關節(jié)軟骨損傷是較為常見的關節(jié)病變，亦是骨性關節(jié)炎重要的病理改變之一，由于軟骨自我修復能力很差，關于軟骨修復的研究是目前骨科及組織工程學研究的熱點和難點。通過有效途徑進行軟骨修復，可在軟骨損傷早期對軟骨病變進行及時干預，防止進一步的骨性關節(jié)炎的發(fā)生，避免患者由于骨性關節(jié)炎影響日常生活甚至不得不選擇接受關節(jié)置換。隨著組織工程技術的發(fā)展，軟骨修復技術取得了巨大的進步。借助于多種生長因子及組織工程支架，結合軟骨細胞及各種干細胞，通過組織工程技術及有效的細胞誘導，制備出多種用于軟骨修復的組織工程軟骨，富血小板凝膠(platelet-rich plasma gel, PRG)是近年來使用較多的組織工程支架之一。富血小板凝膠是將新鮮全血離心得到的含高濃度血小板的富血小板血漿加入激活劑后凝固形成的膠凍物，在激活形成凝膠過程中，通過血小板的脫顆粒作用，可釋放多種高濃度的細胞生長因子，如轉化生長因子β2(TGF-β2)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子β1(TGF-β1)和血管內皮生長因子(VEGF)等[1]。這些生長因子能有效促進細胞增殖和細胞外基質的合成[2]，對組織創(chuàng)傷后修復具有極其重要的作用。本研究分離培養(yǎng)兔軟骨細胞，并與富血小板凝膠復合，觀察富血小板凝膠中軟骨細胞的增殖及細胞外基質分泌情況，為此種組織工程軟骨的構建方法提供理論支持。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1試劑及儀器胎牛血清，雙抗溶液(10 000 U/mL青霉素和10 000 U/mL鏈霉素溶液)，DMEM-HG培養(yǎng)基，0.05%的胰蛋白酶，EDTA，PBS緩沖液，MTT，DMSO，Ⅱ型膠原酶，二甲基亞砜，牛凝血酶，PDGF-AB試劑盒(96T)，TGF-β1試劑盒(96T)，無水氯化鈣，掃描電鏡，酶聯(lián)免疫檢測儀，PCR儀。

1.1.2實驗動物新西蘭大白兔，購于上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司。合格證號碼：SCXK(滬)2012-0007。

1.2實驗方法

1.2.1軟骨細胞的分離和培養(yǎng)取2月齡的兔，麻醉后取部分耳廓軟骨，剝去軟骨膜，切成1 mm3大小組織團塊。PBS沖洗、Ⅱ型膠原酶37 ℃消化8 h，過濾離心后棄去上清，PBS洗滌沉淀細胞，重懸細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，置37 ℃、CO2體積分數(shù)0.05，飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.2.2富血小板凝膠的制備抗凝注射器抽取兔耳緣靜脈血10 mL，以200 rpm離心10 min，吸取全部上清至交界面下3 mm，移至另一離心管，平衡后以200 rpm再次離心10 min，此時離心管中液體分為2層，吸取約3/4上清棄掉，輕輕振蕩混勻，得到富血小板血漿(PRP)。將PRP和激活劑(1 000 U牛凝血酶溶于1 mL 10%的氯化鈣)按照10∶1比例混合，輕搖混勻，室溫靜置30 min，形成凝膠。

1.2.3富生長因子萃取液的提取與檢測將激活凝固的富血小板凝膠在室溫下靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min，吸取全部上清，以針頭式濾器過濾除菌后即可得富生長因子萃取液。以ELISA法檢測其中PDGF-AB、TGF-β1、IGF-1、VEGF的濃度。

1.2.4富血小板凝膠與軟骨細胞復合及檢測將第3代軟骨細胞以0.25%的胰酶消化，PBS洗滌后加入新鮮培養(yǎng)液，輕微振蕩形成細胞懸液，調整細胞濃度至1×106/mL。將PRP與軟骨細胞懸液以4∶1比例混合，輕搖振蕩混勻，按照細胞懸液與激活劑10∶1的比例加入激活劑，室溫靜置30 min凝固，加入10%胎牛血清DMEM-HG培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d換液。

1.2.5掃描電鏡觀察將制成的富血小板凝膠軟骨細胞復合體以生理鹽水反復沖洗，以掃描電鏡觀察其微觀結構，明確軟骨細胞在富血小板凝膠中分布情況。

1.2.6MTT法檢測軟骨細胞增殖情況將第3代軟骨細胞和富血小板凝膠軟骨細胞復合體分別接種至96孔板，于培養(yǎng)的0、1、3、5、7 d分別取出部分樣本，MTT法處理細胞，酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm吸光度值(A值)。

1.2.7realtime-PCR方法檢測軟骨細胞基因表達情況將培養(yǎng)7 d的單純培養(yǎng)軟骨細胞和富血小板凝膠共培養(yǎng)的軟骨細胞行realtime-PCR反應，檢測軟骨細胞內蛋白聚糖、Ⅱ型膠原及SOX-9基因的表達情況。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1富血小板凝膠大體外觀觀察

通過Lendersberg法離心制得的富血小板血漿經(jīng)過激活制得膠凍狀的富血小板凝膠(圖1)。

圖1　離心激活后所獲得的富血小板凝膠

2.2富血小板凝膠萃取液中多種生長因子濃度測定

通過對富血小板凝膠萃取液中多種生長因子濃度檢測發(fā)現(xiàn)，其中的關鍵生長因子濃度較全血中生長因子濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　兔全血和富血小板凝膠中生長因子濃度的比較

2.3富血小板凝膠及復合軟骨細胞后電鏡觀察

將富血小板凝膠及與軟骨細胞復合后的組織工程軟骨處理后行掃描電鏡觀察(圖2)，可以看到示凝膠內部結構呈纖維交織的立體網(wǎng)狀結構，網(wǎng)狀結構的孔隙直徑大小不等，且有大量軟骨細胞附著于支架孔隙中。除此之外還有大量的血小板附著于支架上，并可見少量紅細胞。

圖2　富血小板凝膠復合軟骨細胞掃描電鏡照片

2.4富血小板凝膠復合軟骨細胞對軟骨細胞增殖影響

通過對普通培養(yǎng)軟骨細胞和與富血小板凝膠復合培養(yǎng)的軟骨細胞進行MTT法對比分析發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，富血小板凝膠組軟骨細胞明顯表現(xiàn)出了更強的增殖能力，二者之間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖3　軟骨細胞細胞增殖MTT檢測

2.5不同條件培養(yǎng)下軟骨細胞基因表達檢測

對培養(yǎng)7 d后的不同軟骨細胞行realtime-PCR檢測，結果顯示：與富血小板凝膠復合后的軟骨細胞蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和SOX-9基因表達與普通培養(yǎng)軟骨細胞相比明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)?；蛞镌O計見表2。

表2　基因引物設計

圖4　軟骨細胞相關基因檢測

3討論

富血小板血漿在激活劑的作用下，通過血小板脫顆粒作用，使多種高濃度生長因子由α顆粒中釋放出來，其中很多因子具有促進軟骨細胞增殖和特異基質分泌的作用，如TGF-β、PDGF、VEGF、bFGF等[3-5]。富血小板凝膠是組織工程中常用的軟骨生長因子聚合體，在PRG纖維蛋白骨架部分降解的時候，同樣會釋放出大量的細胞因子，這些細胞因子在細胞量較少及分化困難的細胞再生過程中有著至關重要的作用[3,6-7]。由于多種細胞因子的存在，PRG可以促進軟骨細胞的增殖，并提高細胞外基質(ECM)的表達量，其中就包括蛋白聚糖、Ⅱ型膠原及SOX-9的表達[4-5,8-12]。

PRG本身內部結構及環(huán)境相當于模擬了組織損傷修復時的內環(huán)境。關節(jié)軟骨損傷后，由于軟骨細胞自身修復能力較差，且其所處內環(huán)境并無充分的血液供應及體液供應，導致軟骨損傷后自體修復非常困難。PRG中富纖維蛋白的空間立體結構及高濃度的細胞因子，類似甚至優(yōu)于組織損傷時機體所產(chǎn)生的修復條件。在其三維網(wǎng)狀結構中，軟骨細胞在高濃度的細胞因子的刺激下，充分地利用空間優(yōu)勢進行增殖和表達。其中TGF-β是已知有效的促軟骨細胞增殖和軟骨特異基質代謝的有效細胞因子，可明顯促進ECM的釋放，上調Ⅱ型膠原并抑制Ⅰ型膠原的表達[13-15]；IGF可明顯促進軟骨細胞增殖和ECM合成，并且和TGF-β存在協(xié)同促進作用[16-17]；而FGF和PDGF也同樣有上述作用[18-19]，Kato等[20]研究認為，只有存在FGF時才能使軟骨細胞在增殖過程中的維持表型，甚至將一些成纖維細胞反分化為軟骨細胞。通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，富血小板凝膠在與軟骨細胞混合共培養(yǎng)的情況下，確實能夠明顯促進軟骨細胞的增殖，使軟骨細胞特異性基因Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX-9表達量明顯升高。

通過對PRG的組織學觀察發(fā)現(xiàn)，PRG中血小板在凝膠纖維骨架之中分布均勻且結合緊密，在血小板和凝膠纖維之間沒有明顯的分布區(qū)域差別，同時PRP在與種子細胞充分混勻后才進行激活凝固，使種子細胞在PRG中分布均勻，伴隨著血小板脫顆粒以及凝膠纖維的降解，細胞因子可以獲得穩(wěn)定持續(xù)的釋放，并在一定時期內維持局部細胞因子濃度的穩(wěn)定，使其對軟骨細胞的促增殖和表達的作用能夠維持較長時間。使軟骨細胞并不需要通過細胞遷移作用就可獲得足夠的細胞因子支持，為軟骨細胞的增殖和表達提供了有利條件[21]。

綜上所述，若選用富血小板凝膠作為組織工程軟骨支架，具有以下優(yōu)點：①組織相容性好，降解時長適中，在動物實驗中可以獲得良好的支架效果；②支架中含有豐富的細胞因子，并且釋放均勻，濃度穩(wěn)定，可有效促進軟骨細胞增殖和表達，達到修復軟骨損傷的目的；③PRG的三維立體空間結構是軟骨細胞良好生長依附載體，可使各種細胞因子較好地分布于軟骨細胞周圍，并且有利于細胞代謝所需的營養(yǎng)物質的滲入及代謝產(chǎn)物的排出，細胞在凝膠支架內部可以獲得良好的生長；④采用富血小板凝膠為支架，可以在注射之后再行激活，在臨床應用中可以采取局部注射的方式給藥，使用較為方便。

既往研究通過將富血小板血漿中富生長因子提取液與軟骨細胞進行共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，富生長因子提取液可有效促進軟骨細胞增殖，提高細胞外基質的表達水平[22-24]。但將軟骨細胞與富血小板凝膠復合，使軟骨細胞在含高濃度生長因子的三維結構中增殖和表達的研究很少報道。本實驗將富血小板凝膠與軟骨細胞復合體外培養(yǎng)，可有效促進軟骨細胞增殖和細胞外基質表達，同時富血小板凝膠三維空間結構可為軟骨細胞生長提供更好的空間，使營養(yǎng)物質和細胞因子作用更加充分，后期還可通過富血小板凝膠孔隙率的調整，進一步摸索軟骨細胞生長的最佳孔隙率和空隙直徑，為組織工程軟骨構建提供一個優(yōu)良的方案。

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(編輯：楊穎)

Study of proliferation of chondrocytes co-cultured with platelet rich gel

KANG Jian1, YUAN Wen2, CHANG Zheng-qi1, SUN Hai-ning1, YU Xiu-chun1(1.Bone Section，General Hospital of Jinan Military Region,People’s Liberation Army,Jinan Shandong 250031,China;2.Department of Orthopaedics，Shanghai Changzheng Hospital,Shanghai 200003,China)

Abstract:ObjectivePreparing platelet rich gel through two-times centrifugal technique and co-culturing chondrocytes with PRG, then observing the proliferation and gene expression of chondrocytes, in order to provide a favorable way to prepare tissue engineering cartilage. MethodsCentrifugating venous blood of rabbit through two-times centrifugal technique to obtain platelet rich plasma(PRP),then detecting the concentration of various growth factor in PRP.Admixing PRP with chondrocytes of rabbit and activating them with activator.After co-cultivation,the proliferation of chondrocytes through MTT method and expression of ACAN,Collagen Ⅱ and SOX-9 through realtime-PCR were observed,and compared with common cultured chondrocytes. ResultsThe concentrations of PDGF-AB,TGF-β1,IGF-1 and VEGF in PRG were significantly higher than those in blood(P<0.05).After co-cultivation, the proliferation rate of chondrocytes and the expression of ACAN,Collagen Ⅱ and SOX-9 were significantly higher than that of common cultured chondrocytes(P<0.05). ConclusionCo-culturing chondrocytes with PRG is able to promote the proliferation and gene expression of chondrocytes.We considered that it is a excellent method to construct tissue engineering cartilage.

Keywords:platelet rich gel；chondrocytes;tissue engineering cartilage;growth factor

[收稿日期]2014-12-16[修回日期] 2014-12-25

[通訊作者]于秀淳，E-mail：yxch48@vip.sina.com

doi:10.11659/jjssx.03E015014

[中圖分類號]R684

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)04-0387-04