雷　艷，楊新征，董昭君　(.第三軍醫(yī)大學衛(wèi)勤訓練基地醫(yī)學綜合教研室，重慶 40008；.解放軍第醫(yī)院病理科，吉林 吉林 0；.第三軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學院毒理學研究所，重慶 40008)

·論著·

Rho激酶和PKC在環(huán)孢素A改善休克血管反應性中的作用及與MPTP的關系

雷艷1，楊新征2，董昭君3(1.第三軍醫(yī)大學衛(wèi)勤訓練基地醫(yī)學綜合教研室，重慶 400038；2.解放軍第222醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132011；3.第三軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學院毒理學研究所，重慶 400038)

[摘要]目的觀察Rho激酶和PKC在環(huán)孢素A(CsA)改善創(chuàng)傷失血性休克大鼠血管反應性中的作用及與線粒體通透性轉換孔(MPTP)開放的關系。方法采用創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型和缺氧培養(yǎng)的血管平滑肌細胞(VMSC)，觀察了Rho激酶和PKC在CsA調節(jié)休克血管反應性中的作用，以及對血管平滑肌細胞線粒體MPTP開放的影響，同時觀察CsA對休克動物炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響。結果CsA明顯改善了休克血管反應性，Rho激酶抑制劑Y27632可顯著拮抗CsA恢復休克血管反應性的作用，但是PKC抑制劑staurosporine對CsA的作用無明顯影響。CsA和Rho激酶激動劑U46619都可抑制缺氧后線粒體MPTP的開放程度。休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的濃度均顯著增加，但CsA處理僅使其輕微減少。結論CsA可以通過抑制線粒體MPTP開放改善休克后血管的低反應性，發(fā)揮對創(chuàng)傷休克的治療作用。Rho激酶參與了這其中的調節(jié)過程。

[關鍵詞]線粒體通透性轉換孔；環(huán)孢素A；血管反應性；創(chuàng)傷失血性休克；Rho激酶

環(huán)孢素A(CsA)是一種臨床常見的強效免疫抑制劑。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)CsA對休克有一定的治療作用，其作用主要通過改善休克后血管反應性和器官血流灌注來實現(xiàn)[1]。但是，CsA調節(jié)血管反應性的具體機制尚不清楚。Rho激酶(Rho associated serine/threonine kinase)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是重要的血管平滑肌細胞舒縮功能調節(jié)分子，在休克后血管反應性調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究證實，CsA可以通過抑制線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放，改善心、腦等器官的缺血再灌注損傷[2-3]。那么，CsA調節(jié)血管反應性是否與Rho激酶或PKC有關，其作用是通過免疫抑制或是抑制MPTP開放而發(fā)揮，目前尚不明確。本文采用了創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，觀察CsA對休克后炎癥介質水平的影響及Rho激酶和PKC在CsA調節(jié)血管反應性中的作用，并利用細胞實驗觀察其與MPTP開放的關系，進一步探討CsA發(fā)揮抗休克作用的具體機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑

SD大鼠，體質量(200±20)g，由第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。U46619 (Rho激酶激動劑)、Y27632 (Rho激酶抑制劑)、PMA(PKC激動劑)、Staurosporine(PKC抑制劑)購自美國Sigma公司，Calcein-AM、MitoTracker deep red購自美國Invitrogen公司，TNF-α、IL-1β和IL-6檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.2炎癥介質水平檢測

32只SD大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為：①正常對照組(sham-operated)；②休克組(shock)；③乳酸林格氏液(LR)組；④CsA組(CsA 5 mg/kg)。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠單側股骨折斷，經(jīng)股動脈插管放血，使血壓維持在40 mmHg，持續(xù)3 h，建立創(chuàng)傷失血性休克模型。休克3 h后，LR組經(jīng)股靜脈輸注2倍失血量的LR，CsA組將5 mg/kg的CsA加入LR中輸注。復蘇2 h后取2 mL血液，采用檢測試劑盒測定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.3血管反應性測定

SD大鼠64只，隨機分為8組，每組8只。實驗分組為：①Sham組(正常對照組)；②Shock組(休克處理組)；③LR組(休克+LR)；④CsA組(休克+LR+CsA 5 mg/kg)；⑤CsA+U46619組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+Rho激酶激動劑U46619 10-8mol/L)；⑥CsA+Y27632組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+Rho激酶抑制劑Y27632 10-6mol/L)；⑦CsA+PMA組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+PKC激動劑PMA 10-7mol/L)；⑧CsA+Staurosporine組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+PKC抑制劑Staurosporine 10-7mol/L)。

以相同方法建立休克模型，休克處理3 h后給予CsA 5 mg/kg復蘇，隨后取大鼠腸系膜上動脈，制備血管環(huán)。CsA組在CsA 5 mg/kg復蘇后，直接取血管環(huán)測定反應性；CsA+U46619組、CsA+Y27632組、CsA+PMA組、CsA+Staurosporine組在CsA 5 mg/kg復蘇后，取血管環(huán)平衡后，分別用U46619、Y27632、PMA和Staurosporine孵育30 min，再觀察血管環(huán)的反應性。將血管環(huán)置于K-H液中平衡2 h，待張力曲線平穩(wěn)后，測定血管環(huán)對去甲腎上腺素(NE)的收縮反應性。

1.4線粒體MPTP開放情況檢測

取SD大鼠的腸系膜上動脈進行血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)原代及傳代培養(yǎng)，以缺氧處理的VSMC模擬休克后缺血缺氧狀態(tài)[4]。實驗分為4組：①正常對照組(Normal)；②缺氧組(Hypoxia)；③缺氧+CsA組(缺氧+CsA 1 μmol/L)；④缺氧+Rho激酶激動劑組(缺氧+U46619 10-8mol/L)。

將大鼠腸系膜上動脈的VSMC接種于共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿中，移入缺氧培養(yǎng)罐內，充入缺氧氣體(95%N2和5%的CO2)，達到完全缺氧后開始計時，缺氧處理3 h。缺氧+CsA組在缺氧處理后以1 μmol/L的CsA孵育2 h，Rho激酶激動劑組以U46619(10-8mol/L)孵育30 min。采用calcein-CoCl2法，以MitoTracker deep red定位細胞線粒體，通過激光共聚焦顯微鏡(Calcein 488 nm，MitoTracker 644 nm)檢測線粒體MPTP開放情況。以線粒體中綠色熒光的強度變化反映MPTP的開放程度，熒光強度高反映MPTP開放水平低，熒光強度低反映MPTP開放增加。

1.5統(tǒng)計學處理

2結果

2.1CsA對休克后TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的濃度均明顯增加，顯著高于正常對照組(P<0.01)，輸注LR可使TNF-α和IL-1β濃度進一步增加。給予CsA(5 mg/kg)僅輕微降低了TNF-α和IL-1β濃度，與LR組之間沒有顯著差異。各組的IL-6濃度在休克處理和復蘇治療前后均未出現(xiàn)明顯變化(圖1)。

*：與Sham組比較，P<0.01

2.2CsA調節(jié)休克血管反應性與Rho激酶及PKC的關系

休克后大鼠的血管反應性顯著降低，CsA(5 mg/kg)可明顯恢復休克后血管反應性，效果明顯優(yōu)于單純LR液復蘇(P<0.01)。Rho激酶抑制劑Y27632(10-6mol/L)可顯著抑制CsA升高休克血管收縮反應的作用，最大收縮張力較CsA組顯著降低(P<0.01)；Rho激酶激動劑U46619(10-8mol/L)可使CsA升高休克血管收縮功能的作用進一步增加(圖2)。PKC激動劑PMA(10-7mol/L)和抑制劑Staurosporine(10-7mol/L)對CsA調節(jié)休克血管的反應性無顯著影響。

2.3CsA和Rho激酶對缺氧VSMC線粒體的影響

缺氧處理后，VSMC的熒光強度較正常對照組明顯減弱(P<0.01)，提示缺氧后線粒體MPTP開放顯著增加。CsA(1 μmol/L)和Rho激酶激動劑U46619(10-8mol/L)可抑制缺氧后線粒體MPTP的開放程度，其熒光強度明顯高于缺氧組(P<0.01)，見圖3。

3討論

CsA是一種有效的免疫抑制劑，在臨床上常用于器官移植術后和許多自身免疫疾病的治療。相關研究結果提示，CsA可以通過改善休克后血管反應性和器官血流灌注，對創(chuàng)傷失血性休克的治療起到一定的積極作用[5-6]，但是其具體機制尚不清楚。有研究報道，創(chuàng)傷失血性休克可以引起炎癥應答反應，炎癥因子水平升高，導致組織器官損傷。那么，CsA在創(chuàng)傷失血性休克治療中的作用是否也與抑制這種免疫應答相關，目前尚無明確報道。為此，我們在實驗中觀察了CsA治療前后炎癥介質TNF-α、IL-1β和IL-6的變化情況。結果發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β水平在休克后顯著增高，輸注CsA后僅能使其輕微降低，而IL-6水平在CsA治療前后沒有明顯改變。這一結果說明，在抗休克治療中，短時間給予適宜劑量的CsA不會對免疫因子產(chǎn)生明顯的抑制作用。CsA在抗休克治療中的有益作用主要通過調節(jié)血管反應性而實現(xiàn)，而并非通過免疫抑制。

血管低反應性是影響休克治療效果的重要因素之一[7-8]。血管低反應性導致微循環(huán)障礙，組織缺血缺氧狀態(tài)得不到很好地緩解，組織損傷將進一步加劇。所以，改善血管低反應性是休克復蘇治療的重要措施之一[9-11]。蛋白激酶C(PKC)和Rho激酶是G蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應物。PKC既可以通過激活細胞質中的靶酶參與生化反應的調控，也能作用于細胞核中的轉錄因子，參與基因表達的調控[12-13]。PKCα和PKCε可以通過調節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，影響肌球蛋白輕鏈磷酸化水平，對血管的反應性和鈣敏感性起到調節(jié)作用[14]。Rho激酶是Rho蛋白主要的下游效應靶分子，是調節(jié)細胞運動的重要激酶之一[15]。Rho激酶激活后可以通過激活下游的肌球蛋白輕鏈激酶，或抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，增加肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平，調節(jié)血管平滑肌細胞收縮[16]。通過前期研究[17]我們發(fā)現(xiàn)PKC和Rho激酶在休克后血管反應性的調節(jié)中具有重要作用。在本實驗中，我們觀察了CsA對休克血管反應性的調節(jié)作用及其與Rho激酶及PKC的關系。實驗結果顯示，CsA可以明顯恢復休克后的血管功能，Rho激酶的抑制劑可顯著抑制CsA升高休克血管收縮反應的作用，Rho激酶激動劑可進一步增加CsA升高休克血管收縮反應的作用。提示Rho激酶可能參與了CsA調節(jié)休克后血管功能的過程。

*：與Sham組比較，P<0.01；#：與LR組比較，P<0.01；△：與CsA組比較，P<0.01

圖2各組對去甲腎上腺素的收縮反應性變化

*：與Normal組比較，P<0.01；#：與Hypoxia組比較，P<0.01

圖3各組的熒光強度比較

有研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，CsA可以通過與Cyp D相結合，抑制線粒體MPTP的開放，發(fā)揮對MPTP開放所造成的組織細胞缺血性損害等的保護和治療作用。在本實驗中，我們以缺氧處理的VSMC模擬休克后血管的缺血缺氧狀態(tài)，探討CsA調節(jié)休克血管的反應性是否與抑制MPTP開放有關。我們觀察到，缺氧處理使VSMC的MPTP開放顯著增加，CsA和Rho激酶激動劑可以抑制缺氧后MPTP的開放。實驗結果提示，CsA可以通過抑制線粒體MPTP開放來改善休克后血管反應性，從而發(fā)揮抗休克作用，Rho激酶可能參與了這一過程的調節(jié)。

綜上所述，在創(chuàng)傷失血性休克的治療中，CsA可通過抑制線粒體MPTP開放，改善休克后血管的低反應性，改善組織血液灌注和器官功能而發(fā)揮有益作用，并非通過免疫抑制途徑。Rho激酶可能參與了這其中的調節(jié)過程。但是，Rho激酶在這一過程中的具體作用及其與線粒體MPTP開放的關系如何，還需要更深入的研究來證實。

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(編輯：周小林)

Role of Rho-kinase and PKC in cyclosporine A regulating vascular reactivity and it relationship to MPTP after traumatic hemorrhagic shock

LEI Yan1,YANG Xin-zheng2,DONG Zhao-jun3(1.Department of General Medicine,Medical Service Training Base, Third Military Medical University,Chongqing 400038,China;2.Department of Pathology,the 222th Hospital of PLA,Jilin Jilin 132011,China;3.Institute of Toxicology,College of Military Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship of the beneficial effect of CsA on vascular reactivity to Rho-kinase,protein kinase C (PKC) and mitochondrial permeability transition pore (MPTP) in traumatic hemorrhagic shock rats. MethodsWith traumatic hemorrhagic shock rats and hypoxia-treated vascular smooth muscle cells (VSMCs),the role of Rho-kinase and PKC in CsA-regulating vascular reactivity following shock and their relationship to MPTP was observed.Meanwhile,the effects of CsA on inflammatory mediators including TNF-α,IL-1β and IL-6 were also studied. ResultsCsA significantly improved the vascular reactivity of superior mesenteric artery following hemorrhagic shock.Rho-kinase inhibitor Y27632 significantly antagonized CsA-induced increase of vascular reactivity,while PKC inhibitor staurosporine had no significant influences on the effects of CsA.Further studies showed that CsA and Rho-kinase agonist U46619 inhibited the opening of MPTP in hypoxia-treated VSMCs.In addition,shock induced a significant increase of TNF-α and IL-1β,but CsA did not show a significant inhibitory effect on their level. ConclusionCsA-induced restoration of vascular reactivity following traumatic hemorrhagic shock via inhibiting MPTP opening,and Rho-kinase participate in this process.

Keywords：mitochondrial permeability transition pore;cyclosporine A;vascular hyporeactivity;traumatic hemorrhagic shock;Rho associated serine/threonine kinase

[收稿日期]2015-03-10[修回日期] 2015-04-16

[基金項目]國家自然科學基金(81270400)

doi:10.11659/jjssx.03E015007

[中圖分類號]R605.971

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)04-0355-04